변성패각과 제타전위에 대한 결정내부단백질의 영향에 관한 연구

윤은선, 용동희, 김용완, 최청송

서강대학교 화학공학과

Effects of intracrystalline protein on deformed oyster shell and zeta potential

Eun-Sun Youn, Dong-Hee Yong, Yong-Wan Kim, Cheong-Song Choi

Dept. of Chemical Engineering, Sogang University

1. 서론

패각을 형성하는 탄산칼슘(biogenic crystal)은 결정내부단백질과 다당류 등과 같은 macromolecules과 결합되어 자연상태의 탄산칼슘(abiotic crystal)보다 수천배의 강도와 미세크기를 갖추게 된다. 일반적으로 inorganic crystal무기물과 단백질의 상호 구조적 관계는 제어된 핵생성과 성장을 위해 결정내부단백질이 template로 작용하는 것으로 알려졌다. 따라서 결정내부단백질의 특성에 관한 연구는 패각변성에 있어서 중요한 지표가 될 것이다. 패각은 -(Gly-Pro-X)- 아미노산사슬을 가지며 구조적 뼈대를 형성하는 비수용성 단백질과 판상형태의 미세크기 탄산칼슘으로 구성되어 있다. 단백질과 탄산칼슘phase은 같은 lattice complex에서 결합하므로, 패각변성은 결정체 phase boundary가 파괴되는 순간 진행된다고 추측되어지며 비수용성 단백질은 대략 0.1-0.15%의 질량비를 가진다. 한편 패각의 구조형성에 주요한 역할을 하는 것으로 알려진 chitin은 일반적으로 갑각류에 많이 포함되어 있고, 생합성되는 양은 년간 수십억톤으로 아미노다당 중에서 가장 많은 양으로 추정되고 있다. 키틴, 키토산의 이용은 그 수용성 유도체를 통한 산업적 이용이 관심을 모으고있고 의용재료, 의약, 화장품, 섬유, 식품에의 응용, 항균·항곰팡이제, 분리막 및 폐수처리 응집제 등 여러 분야에서 활발한 연구가 행해지고 있다.([1,2]) Chitin(poly-□-(1-4)-N-acetyl-D- glucosamine)은 □-Chitin과 □-Chitin이 있으며, □-Chitin은 갑각류 외각의 주요 구성성분이다. 본 연구에서는 정상적인 패각과 변성되어 자연상태의 강도와 형태를 갖지 못한 변형된 패각을 morphology와 structure를 이용 층분리를 수행하였다. 층별 조직에서 키틴의 함유량의 차이와 soluble 단백질과 경질단백질의 아미노산 조성분포의 차이점을 확인하였으며 gel filtration chromatography를 이용하여 분자량의 분포를 확인하였다. 결정내부단백질의 2차구조는 액체-ATR을 이용하여 수행하였다. 또한 powder X-ray diffraction을 이용하여 미세결정크기를 측정하였으며 이를 통해 변성이 패각의 미세조직에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 zetasizer를 이용하여 층별 제타전위를 측정하여 합성된 탄산칼슘과 비교하여 패각조직내에 intercalated 되어있는 결정내부단백질의 특성을 비교,분석하였다.

2. 실험

참굴 패각을 깨끗이 세척한 후 5% NaOH용액에 72시간 함침시키고 여러 번 증류수로 세척하여 굴껍질 표면의 이물질 및 잔여 알칼리를 제거하였다. 건조된 패각을 변성된 것과 그렇지 않은 것으로 구분하여 각 층별로 mini-grinder를 사용하여 박층분리를 행하였다. 분리된 각 층의 결정과 합성된 결정의 미세결정크기를 RIKAKU powder X-ray diffractometer(CuK □ radiation, rotating anode 30kV & 20mA)를 이용하여 조사하였다. 데이터는 0.05°/10sec의 속도로 산란각(2□)은 15°에서 110°까지 측정하였으며 모든 측정은 □/2□ 모드로 수행되었다. 결합길이(coherence length, CL)는 특정한 결정학적인 방향에서 결함들간의 평균거리를 나타내며, 이것은 Scherrer equation: CL=k□/(cos□)(□)을 이용하여 분산 peak의 폭에서 결정되어진다(□;wavelength, □;Bragg angle, k;shape factor(0.89-1.39), □;halfwidth). 본 연구에서는 □=1.5405Å, k=0.9로 정하였으며, 다음의 중요 {hkl}결정면에 대한 분석을 행하였다:(202), (111), (012), (116), (104), (110), (018), (113). 분리된 패각에서 결정내부단백질의 분리정제는 다음과 같이 수행하였다.  각층의 시료들을 1N HCl을 이용하여 30분간 CaCO3을 제거하고(decalcification) 원심분리(10000g, 10min)하여 soluble matrix들을 분리하고 침전물을 65℃ 5% NaOH로 1시간 처리후 원심분리하여 상층액으로 insoluble protein을 얻고 그 잔류물로 chitin을 얻는다. 분리된 단백질수용액들은 Bio-Rad의 liquid-ATR FTS-60(scan number 64, resolution 8□-1)을 이용하여 amide 1특성 peak를 얻었으며 Origin5.0을 이용하여 Gaussian curve-fitting을 수행하여 단백질의 2차구조를 해석하였다. 분석후 각 단백질 수용액들은 초순수(Milli-Q water purification system)로 24시간 투석(SIGMA dialysis tubing)후 동결건조(EYELA freeze dryer, FD-81)시켜 보관하며, chitin은 초순수로 여러 번 세척하여 잔여 알칼리를 제거하여 건조하였다. 동결건조된 단백질과 chitin을 각각 KBr과 섞어 지름 10mm의 pellet을 만들고 spectrum은 MIDAC GRAMS FT-IR을 이용하여 얻었다.

아미노산 조성분석을 위해 동결건조된 단백질을 100□ 증류수에 현탁한 후 20□씩 취하여 완전히 말린다. 시료를 110℃에서 24시간동안 6N HCl을 이용하여 진공에서 가수분해하였다. 가수분해된 아미노산을 PITC(phenylisothiocyanate)로 유도체화시킨다. 시료를 완전히 말린후  pH6.3, 200□의 1.4mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH3CN에 녹인다.  Microcentrifuge시킨후 상층액을 각각 50□씩 따서 합쳐 섞은 후 HPLC(Waters PicoTag System)의 autosampler에 안치시킨다. 사용한 column은 PicoTag이며 Photodiode array detector(Waters 990 254nm)를 사용하였으며 60% CH3CN으로 선형 gradient를 사용하였다.

CaCO3의 결정성장은 밀폐된 dessicator안에서 3일간 pH 7.0,  1□의 7.5 mM CaCl2용액과 (NH4)2CO3의 증기상 확산을 이용하였다. 세척액으로 표면처리된 지름 15□ 유리cell을 지름 20□ 결정성장cell에 놓고 1□의 7.5 mM CaCl2용액을 붓는다. 성장cell에 알루미늄호일을 덮고 바늘을 이용, 여러개의 구멍을 뚫는다. (NH4)2CO3 10g을 담은 용기가 들어있는 dessicator에 성장cell을 넣고 밀폐시킨다.  (NH4)2CO3의 확산을 통해 성장cell내에서 CaCO3의 결정화가 일어난다. 3일후 결정이 붙은 유리cell을 SEM과 FTIR을 이용하여 결정상과 형태를 조사하였다. 이때 형성된 결정을 이용 Malvern instrument의 zetasizer 3000을 이용하여 zeta전위를 측정하였으며 pH의 변화에 따른 zeta전위의 변화를 측정하였다. 또한 변형된 패각에서 분리된 안층, 중간층, 바깥층과 myostracum에서 추출된 단백질을 additive로 이용하여 동일한 조건에서 zeta전위를 측정하였다. 이결과를 이용하여 층별 조직을 suspension 하였을때의 zeta전위와 비교하여 결정내부단백질이 패각조직에 미치는 영향을 조사하였다.

3. 결과 및 고찰

패각을 형성하는 탄산칼슘에 intercalated 되어있는 결정내부단백질은 일반적으로 패각형성에 중요한 기여하며 특히 패각형성의 구조적 역할을 하는 다당류와 단백질들 간에 상호결합이 작용하는 것으로 알려졌다. 패각의 유생에서 성장세포는 organic matrix과 같은 거대분자군(macromolecules)의 작용으로 calcium carbonate와 구조적 골격을 형성하며, 미리 형성된 이러한 골격 내에서 제한된 핵생성과 성장을 통해 미세크기의 aragonite와 calcite가 형성된다. 따라서 패각내 intracrystalline protein의 물리적, 화학적 연구는 패각의 biomineralization에 대한 이해 및 응용을 위해 많은 연구가 수행되고 있다. 패각의 뼈대를 구성하는 경단백질의 아미노산 분포를 정상적인 패각과 변성된 패각으로 비교한 결과를 Table 1에 나타내었다. 패각의 변성 시 경단백질 중 비극성 아미노산의 함량이 증가하며 극성 아미노산 중 중성 아미노산의 함량이 뚜렷이 감소하는 경향이 보였다. 변성패각내의 경단백질은 정상패각과 비교하였을 때 Glycine의 함유량이 낮았으며 Proline의 함량은 증가하였다. 단백질과 polysaccharide를 연결하는 Serine은 정상적인 패각에서는 20%의 함량을 보이며 변성패각에서는 약 3% 적게 분포하는 것으로 나타났다. 또한 같은 질량의 패각을 분석하였을 때 정상적인 패각은 변성되어 본연의 강도를 유지하지 못하는 변성된 패각보다 3배이상의 chitin을 함유하고 있음을 알수 있다. 이와같이 구조적 골격을 형성하는 경질단백질에서 아미노산조성분포의 차이와 더불어 다당류 중의 하나인 키틴 함유량의 감소는 탄산칼슘의 생성과 성장의 변화와 관련이 있을 것으로 생각된다. 키틴을 진한 알칼리 중에서 가열하면 탈아세틸화 반응에 의해 acetyl group이 수소로 치환되면서(그림 1) 키토산이 되는데 키틴의 탈아세틸화도는 Sannan등에 의한 방법[3]으로 1878Å과 2787Å의 흡광도의 비를 계산하여 구하였으며 72.7% deacetylation이 진행되었고 이것은 Sigma의 9.8% 탈아세틸화도에 비해 상당량 deacetylation이 되었음을 알 수 있다. 그림 2는 키틴의 IR spectrum을 나타낸 것으로 chitin의 특성 peak인 1626cm-1(C=O streching에 의한 amideⅠvibration)과 1150cm-1(NH bending에 의한 amideⅡ vibration)에서 강한 흡수 peak를 나타내고 있다[4]. 한편 powder X-ray diffraction을 이용하여 층별 패각의 미세결정크기를 측정한 결과, 합성된 결정보다 등방성이었으며 특히 합성결정의 평균미세결정크기가 400nm 이상이었던 반면 패각은 180nm으로서 패각에 존재하는 결정내부단백질에 의해 핵생성과 성장이 상당히 제어되었음을 알 수 있었다. 또한 biogenic 탄산칼슘과 결합되어있는 결정내부단백질은 각 층별 조직의 표면전위에 상당히 큰 영향을 미친다는 것을 알수 있었다. 즉 합성된 탄산칼슘의 제타전위는 -12.5mV였으나 층별 패각, 특히 aragonite로 형성되어진 myostracum은 15mV의 전위값을 보였다. 이러한 결과를 통하여 패각내에 intercalated되어 있는 결정내부단백질은 초기 패각형성시 핵생성과 성장에 중요한 역할을 수행하여 각 층별 고유의 morphology와 structure를 갖추며  이러한 단백질의 변성을 통해 본래의 강도와 형태를 잃는 것으로 보인다.

참고문헌

1. Sakurai, K. : SEN-I GAKKAISHI, 46, 12, 553 (1990).

2. MiMa, S., Miya, M., Iwamoto, R. and Yoshikawa, S. : J. Appl. Polym. Sci.,         28, 1909 (1983).

3. T. Sannan, K. Kurita, K. Ogura and Y. Iwakura(1978), polymer, 19, 458

4. R. A. A. Muzzarelli(1972), Natural Chelating Polymers, 120, Pergamon Press

fig . chemical structure of chitin

Table 1. Classifying Amino Acid

fig 2. IR spectrum of chitin