Microsphere를 이용한 연속식 단백질 분리 공정에 있어서의

Flux 변화 고찰

최성욱, 윤정열*, 함승주, 정준기**, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과, *연세대학교 산업기술연구소,

**생명공학연구소 실용화연구사업단

Flux Variation in the Continuous Separation of Proteins Using Microspheres

Sung-Wook Choi, Jeong-Yeol Yoon*, Seung-Joo Haam, Joon-Ki Jung**,  Woo-Sik Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei University, *Engineering Research Institute, Yonsei University, **Biopilot Plant Division, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

서론

단백질 분리 및 정제는 화학, 생화학, 생물학, 의학, 화학공학, 식품공학 등 많은 분야에서 필수적이고 기본적인 조작이다. 단백질 분리 및 정제는 주어진 공정에 도입되기 전에는 벌크상의 단백질을 정제하기위해, 공정에서 배출되는 경우에는 분리와 분석을 위해 필요하다. 때문에 단백질 분리 및 정제에 대하여 크로마토그래피(HIC, IEC), 친화크로마토그래피, 침전법, 친화침전법, 회분식 흡착, 겔 전기영동(SDS-PAGE), 등전초점화법(IEF), 막분리, 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 장 흐름 분획법(FFF) 등 다양한 방법이 연구개발되어 왔다.

본 연구팀에서는 1992년 이후 microsphere에의 단백질 흡착에 관여하는 상호작용력에 대한 연구를 집중적으로 수행하여, 세가지 상호작용력 - 소수성 상호작용력, 정전기적 상호작용력, 수소 작용력 - 의 상호관계를 최초로 규명해 내었다[1-3]. 이 결과를 이용하면 microsphere 표면에 단백질이 선택적으로 흡착/탈착하는 것을 정확히 제어할 수가 있으며, 본 연구팀에서는 회분식 실험을 통해 성공적으로 단백질을 분리해낸 바 있다[4].

한편, 본 연구팀은 단백질 분리의 연속 공정 개발을 위하여 단백질 농축/정제, 라텍스 정제에 사용되는 stirred cell을 크로마토그래피의 칼럼대신 사용하여 연속식 분리 공정도 개발하였다[4-5]. 회분식 흡착 분리 연구 결과 낮은 표면전하밀도의 microsphere가 높은 선택도를 나타내었으며 그 주 구동력은 소수성 상호작용력이었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 연속식 분리 실험을 행하였으며 혼합 단백질간의 흡착 거동시 상호영향 및 flux에의 영향을 고찰한바 있다. 그러나 이러한 결과는 평균 flux만을 고찰한 결과이며, 시간에 따른 flux연구는 아직 체계적으로 연구되지 못하였다. 따라서 본 연구에서는 시간에 따른 flux의 변화를 고찰하여 이를 단백질 분리 공정의 scale-up을 위한 기본 자료로 이용하고자한다. Metering pump를 사용하지 않는 본 공정에 있어 시간에 따른 flux 변화 고찰은 가장 중요한 인자이다.

이론

Microsphere에의 단백질 흡착은 microsphere의 리간드와 buffer의 pH 등을 조절하여 흡착/탈착 조건을 만들어 줄 수 있다. 본 연구에서는 음이온성PS/PMAA microsphere에 BSA를 흡착시켜 실험을 행하였다.

투과용액은 파과곡선을 그리게 되고, 파과점 전까지는 단백질이 microsphere에 흡착되며 파과점 이후에는 microsphere가 단백질에 의해 포화되어 더 이상 흡착하지 못하고 stirred cell을 통과하여 빠져나오게 된다. Fig. 1에 단백질 농도에 따른 파과곡선을 나타내었다. 대부분의 막분리공정은 두 성분이나 세 성분이 녹아있는 용액을 막에 통과시켜 분리해내는 과정이다. 따라서 농도분극과 fouling으로 인하여 flux가 감소된다[6-7]. 두 성분의 경우 한 성분은 입자 크기 때문에 막에 의해 배제되고 다른 한 성분은 막을 통과하게 된다. 그러나 본 연구에서는 microsphere가 sitrred cell에 채워져 있고, 단백질 용액을 투입하여 흡착과정에 의하여 단백질이 분리되는 것이다. 따라서 일반적인 막분리공정과는 분리 메카니즘이 다르다.

실험

단백질은 Sigma Chemical Co.의 bovine serum albumin (BSA, A-7906)을 탈이온 증류수에 용해시켜서 사용하였다. Stirred cell은 Amicon사의 50 ml 급을 사용하였다. Microspheres는 무유화제 유화공중합법을 이용하여 PS/PMAA microsphere를 제조하였다. 완충용액은 pH 4.5의 acetic buffer를 사용하였으며 이온강도를 0.01로 고정하였다.

Acetic buffer와 라텍스를 0.2 □m 정밀여과막 (Orange Scientific Co.)을 장착한 stirred cell에 넣어 전체 부피는 30 ml, 비표면적은 0.19 m2/ml로 만든다. Stirred cell을 교반기 위에 놓고, 약 1 m위의 높이에서 같은 buffer를 흘려주어 permeate flux를 정상상태로 만든다. 정상상태에서의 permeate flux는 Jo로 표시한다.

완전히 투과 플럭스가 정상상태로 된 후에 단백질을 step input한다. 시간에 따라서 투과 플럭스의 변화를 살펴보기위해 stirred cell을 통하여 나오는 용액을 autosampler로 받게된다. 받은 용액은 UV로 분석한다. 위와 같은 실험을 stirred cell rpm (250, 400)과 BSA 단백질의 농도(0.1, 0.2, 0.4 g/L)를 변화시켜 반복한다.

실험장치는 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1 separation apparatus     Fig. 2 SEM photograph of microspheres.

결과 및 토의

1. PS/PMAA의 특성분석

본 연구에 사용된 PS/PMAA의 SEM 사진을 Fig. 2에 나타내었다. PS/PMAA는 styrene을 주단량체 MAA를 공단량체로 하여 회분식 공중합하였으며, 카르복시 기를 갖는다. Nc (number density of surface carboxyl groups)는 0.45 nm-2이며, 수평균 직경(Dn)은 452 nm이다.

2. 파과곡선 고찰

Fig. 3에서 보듯이 단백질 용액의 농도가 0.1 g/L의 경우는 100 ml에서 파과가 이루어 지며, 0.2 g/L는 50 ml, 0.4 g/L는 25 ml, 1.0 g/L는 10 ml에서 각각 파과가 이루어 진다.

3. 투과 flux 고찰

투과 flux를 나타낸 Fig. 4, 5를 살펴보면 각각의 시간에 따른 투과 flux는 증가하다가 다시 감소하는 경향이 있음을 알 수 있었다. 이를 Fig. 3의 파과 곡선에 나타난 파과점과 비교하여보면 단백질이 microsphere에 흡착되는 동안에는 flux가 증가하고 포화된 이후에 감소한다는 것을 알 수 있다. 일반적인 막 분리 공정에서는 파과가 진행함에따라 투과 flux가 감소하므로[6-7], 본 연구결과와는 상이하다고 할 수 있다. 파과점 이전까지 flux가 증가하는 것은 다음과 같이 설명할 수 있다. 단백질이 흡착된 microsphere는 안정성을 잃어버려 membrane표면 위에 가라앉게 되고, effective diameter가 커져서 flux가 증가하게 된다. 이 과정은 microspheres가 단백질로 포화될 때까지 계속되며 포화 흡착된 후에는 단백질이 membrane을 투과하게 되고 membrane pore에 흡착되어 기존 막 분리공정과 마찬가지로 flux는 감소하게 된다.

참고문헌

1. J.-Y. Yoon et al., J. Colloid Interface Sci., 177, 613 (1996)

2. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 12, 15 (1998)

3. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, in press (1999)

4. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 10, 365 (1998)

5. J.H. Lee et al., Biomed. Chromatogr., 12, 330 (1998)

6. S. Bhattacharjee and P.K. Bhattacharya, J. Membrane Sci., 136,57

(1997)

7. S. Bhattacharjee et al., J. Membrane Sci., 111,243 (1996)