메탄올 유도시 용존산소농도가 재조합 Pichia pastoris에 의한

외래단백질 발현성능에 미치는 영향

이 춘 연, 1정 경 환, 이 은 규

한양대학교 화학공학과 생물공정연구실, 1(재)목암생명공학연구소 발효연구실

Maintaining higher dissolved oxygen tension during methanol induction tends to enhance heterologous protein expression by recombinant Pichia pastoris

Chun Yeon Rhee, 1Kyung Hwan Jung, Eun Kyu Lee

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

1Mogam Biotechnology Research Institute, Fermentation Lab

서론

Methylotrophic yeast의 일종인 Pichia pastoris내의 강력한 alcohol oxidase (AOX1) promotor를 이용한 외래단백질(heterologous protein) 생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.  재조합 P. pastoris 배양에는 유가식 배양방법을 사용하고 있으며, 전체배양공정은 AOX1 promotor를 derepress시키면서 세포농도를 고농도로 배양하는 derepression 단계와 기존 탄소원인 glycerol을 완전히 소비시킨 후 발현 유도물질임과 동시에 세포의 탄소원으로 쓰이는 methanol을 공급하여 외래단백질의 발현을 유도하는 induction 단계로 구성되어 있다.  각각의 단계에서 glycerol과 methanol의 농도는 growth-limiting rate으로 주입시켜 낮게 유지하는 것이 좋기 때문에 통상 DO-stat 방법을 이용하고 있다.  재조합 P. pastoris를 이용해 외래단백질을 고발현시키기 위하여는 inducer로 사용되는 methanol의 대사반응중 높은 속도로 소모되는 용존산소를 원활히 공급시켜 주어야 하며 이는 발효공정의 scale-up시 중요한 문제점으로 대두되고 있다.(1)  본 연구에서는 derepression과 induction 단계의 DO-stat에서의 DO 설정농도를 변화시키면서 이 DO 농도가 세포성장 및 외래단백질의 발현에 미치는 영향을 실험적으로 관찰하였다.

재료 및 방법

균주 및 발효조건  재조합 P. pastoris는  GS115 strain (his4 genotype, Mut+His- phenotype)으로 (재)목암생명공학연구소에서 기증받아 사용하였다.  Flask 및 5리터 발효조 (Biostat B5, B. Braun Biotech, 독일) 배양에서의 배지성분 및 발효조건 등은 이전 실험(2)과 동일하게 유지하였다.

외래단백질   EIP(elastase inhibiting peptide)가 외래단백질로 발현되었다. 이 EIP는  한국산 거머리로부터 추출정제된 유전자로서 elastase에 대한 specificity가 매우 뛰어난 것으로 알려져 있다.(3)  EIP는 57개의 아미노산 잔기로 구성된 polypeptide로서 (분자량은 6,110) elastase의 작용을 억제시키는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.

DO-stat   본 실험에서 사용한 DO-stat에서는 DO 농도의 범위를 설정한 후 DO 농도가 상한치에 도달하면 glycerol 또는 methanol의 주입이 시작되고 하한치에 도달하면 주입이 정지되게 하여 기질의 농도를 낮게 유지하였다.  약 20시간의 회분식 발효에 이어 500 ml의 80%(w/v) glycerol을 1.6 ml/min으로 공급하였고 이 때 DO 농도의 범위는 10-50% air saturation으로 하였다.  Glycerol 주입이 완료된 후 약 30-60분간 양분고갈상태로 두어 잔존 glycerol을 모두 소비시킨(glycerol starvation) 후 500 ml의 100%(v/v) methanol을 공급하였다.  약 70시간의 induction 단계에서는 DO 농도의 범위를 10-50%로 유지하여 methanol 농도를 약 0.1% 이하로 유지하였다.

OEM(oxygen enriching membrane)   이 장치는 반투과성의 고분자 멤브레인을 사용하여 압축공기를 95% 이상의 농축질소(retentate stream)와 28-38%의 농축산소(permeate stream)로 분리하는 장치이다.(2)  이 장치는 기존의 순수산소와 압축공기를 혼합시켜 산소분압을 올리는 방법을 대체하여 외래단백질 발현을 약 15% 증가시킬 수 있었으며 특히 500L 이상의 대규모 발효시 경제성이 매우 우수한 것으로 분석되었다.(4)  따라서 본 실험에서는 약 38% 산소분압의 농축산소를 2 L/min의 유속으로 발효초기부터 주입하였다.

분석방법   발효액내 균체농도는 분광광도계(Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech)를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 발현된 EIP의 농도분석은 참고문헌을 따랐다.(4)  발효액내 glycerol과 methanol 농도는 발효액을 원심분리 및 여과(0.2 □m)후 각각 HPLC(Gilson, model 302)와 가스크로마토그래피((주)도남인스트루멘트, DS6200)로 분석하였다.

결과 및 토의

세포농도, 기질농도 및 EIP 발현 profile   Fig. 1에 세포, glycerol, methanol 및 EIP의 농도변화를 나타내었다(batch #4).  초기세포성장단계에서는 약 15-20시간에 걸쳐 glycerol 농도가 선형적으로 급격히 감소하였고, 이어서 derepression 단계에서는 glycerol의 농도가 낮게 유지되면서(1.6 g/L이하) 고농도의 세포성장이 진행되었다.  Induction 단계에서도 methanol의 농도는 60 mg/L이하로 낮게 유지되면서 EIP의 발현이 일어나는 것을 볼 수 있었다.

Derepression DO set point의 영향  Derepression시 DO set point의 변화가 세포의 비성장속도(specific growth rate, □)에 미치는 영향을 관찰하였다.  DO set point의 하한치를 10%로 일정하게 한 후 상한치를 40%에서 30%로 낮추어 줌에 따라 비성장속도가 평균 0.033 h-1에서(#1와 #2는 동일반복실험임) 0.057 h-1로(#3과 #4는 동일반복실험임) 증가하였음을 보였다 (Table 1 "Derepression sp. growth rate" 칼럼 참조).  이는 DO 농도가 하한치에 도달하여 glycerol 주입이 정지된 후 다시 DO가 상한치에 도달할 때까지의 시간은 glycerol 고갈상태이기 때문에 상한치를 높여주었을 때는 고갈상태가 더욱 오래 지속되어 세포성장에 부정적인 영향을 미치기 때문인 것으로 사료된다.  따라서 하한치와 상한치의 폭을 좁게 유지하여 glycerol 주입이 자주 반복되게 하는 것이 비성장속도를 증가시키기 위해 유리할 것으로 판단된다.

Induction DO-set point의 영향  P. pastoris (Mut+)은 발효액내 methanol 농도를 거의 0에 가깝게 유지하면서 DO 농도를 20-70%로 유지해야 한다.(5) 전체 발효실험은 induction 단계의 DO set point를 derepression DO-set point보다 높게 하여 발효를 진행하였다.  실험 #0-#2에서는 DO 농도를 10-50%로 실험 #3, #4에서는 30-50%로 설정하여 높은 DO 농도가  EIP 발현에미치는 영향을 조사하였다.  그 결과 실험 #0-#2의 EIP 총발현농도는 평균 328 mg/L이었고, #3-#4는 988 mg/L로서 DO-stat의 하한치를 증가시킴에 따라 약 3.0배 증가됨을 관찰하였다 (Table 1 "Expression titer" 칼럼 참조).  비발현농도(specific EIP expression titer) 역시 3.1 mg-EIP/g-cell에서 9.4 mg-EIP/g-cell로 약 3배 증가함을 알 수 있었다 (Table 1 "Sp. expression titer" 칼럼 참조).  따라서 methanol induction시 DO 농도의 영향은 EIP의 고농도 발현에 결정적인 영향을 미치는 것으로 나타났고 따라서 OEM을 이용하여 DO 농도를 높게 유지시키는 것이 발현성능 향상에 중요한 것으로 판단된다.

각 단계별 비기질소비속도(specific substrate consumption rate)   전체발효공정을 3 단계, 즉 (1) 회분식 발효에 의한 초기세포성장단계, (2) 유가식 발효에 의한 derepression과 (3) induction단계로 구분하여 각 단계에서의 비기질소비속도를 비교하여 Table 2에 나타내었다.  초기성장단계에서의 glycerol 소비속도는 평균 0.22 g-glycerol/g-cell/h로 큰 차이가 없었다.  Derepression 단계에서의 glycerol의 비소비속도는 평균 0.15 mg-glycerol/g-cell/h이었다.  Induction 단계에서의 methanol의 비소비속도는 #3-#4에서 DO 농도를 높게 유지하였을 때가 #1-#2보다 높게 나타났다.  이는 DO 농도를 높게 유지함이 methanol 대사를 촉진시켜 EIP의 발현을 향상시킨다는 관찰을 뒷받침한다고 할 수 있다.

결론

재조합 P. pastoris의 발효를 통한 EIP의 고농도발현에서 derepression과 induction단계에서의 DO-stat set point의 영향을 실험적으로 조사하였다.  Derepression시에는 DO control band를 좁게 유지하여 glycerol이 자주 주입되게 하는 것이 세포성장속도를 증가시키는데 유리하였고, induction시에는 DO 농도를 높게 유지함이 methanol의 대사를 원활히 하여 고농도로 발현하는데 결정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.  이렇게 DO 농도를 높게 유지하는 방법으로서 OEM을 이용하는 방법을 제시하였다.

참고문헌

1. Higgins, D. R. and Cregg, J. M., (1998) "Introduction to Pichia pastoris" (in  Pichia protocols)  Humana Press, Totowa, NJ, p. 12.

2. Lee, S. J. and Lee, E. K., Oxygen enriching membrane system as a new means of supplying oxygen to a fermentor, Theories and Applications of Chem. Eng. (Biochem. Eng.) Vol 4. No.2, pp. 3045-3048

3. Jung, H. I.. Kim, S. I., Ha, K. S., Joe, C. O. and Kang, K. W. (1995) "Isolation and characterization of Guamerin, a new human leukocyte elastase inhibitor from  Hirudo nipponia". J. Biol. Chem., 270(23), 13879-13884.

4. Lee, S. J., (1998) "Fermentation and purification process development using oxygen enriching membrane system for recombinant Pichia pastoris expressing elastase inhibitor peptide", MS Thesis, Dept. of Chem. Eng., Hanyang University,  Seoul, Korea, pp. 12-14.

5. Wolf, K. (1996) "Noncoventional yeasts in biotechnology: A Handbook", Springer,  p. 215.

Table 1. DO-setpoint 변화에 따른 EIP발현비교

Batch No.	pre-induction sp. growth rate (h-1)	D.C.W (g/L)	EIP expression titer (mg/L)	sp. expression titer (mg-EIP/g-cell)	DO-stat set point (low-high)	Airation method	Remark
#0	0.0219	105	410	3.9	10-50 10-50	OEM	derepression induction
#1	0.0270	106	320	3.01	10-40 10-50	OEM	derepression induction
#2	0.0399	110	253	2.3	10-40 10-50	OEM	derepression induction
#3	0.0517	117.6	1200	10.2	10-30 30-50	OEM	derepression induction
#4	0.0632	89.5	776	8.67	10-30 30-50	OEM	derepression induction

Table 2.  P. pastoris 발효공정에서 각 단계별 비기질소비속도

Batch No.	cell growth phase (g-glycerol/g-cell·h)	derepression phase (g-glycerol/g-cell·h)	induction phase (g-MeOH /g-cell·h)	Remark
#0	0.317	0.180	0.080
#1	0.200	0.00036	0.052
#2	0.127	0.210	0.054
#3	0.197	0.184	0.105
#4	0.276	0.336	0.082