In situ 색소흡착을 이용한 추출발효의 특성

배정돈, 김창호*, 김승욱, 홍석인

고려대학교 화학공학과

버밍엄 대학교 화학공학과 생물화학공학연구센터*

Characteristics of Extractive Fermentation Using in situ Pigment Adsorption

Jungdon Bae, Chang-Ho Kim*, Seung-Wook Kim, Suk-In Hong

Department of Chemical Engineering, Korea University, Seoul

Biochemical Recovery Group, Centre for Biochemical Engineering

School of Chemical Engineering, University of Birmingham, UK*

서론

Serratia sp. KH-95에 의해서 생산되는 prodigiosin계 적색색소는 2차대산산물로서 배양 중 축적되어 생산물의 생산을 저해함으로써 색소생산을 감소시키는 것으로 알려져 있다[1]. 이러한 생산물 저해를 최소화시켜 색소생산을 증가시킬 수 있는 방법 중의 하나가 흡착제를 이용하여 색소를 배양액으로부터 회수하여 생산성을 증가시키는 것이다.

본 연구실에서 수행되었던 여러 흡착제에 대한 실험 중에서 Diaion HP-20 (Mitsbuishi) 흡착제가 가장 효율이 좋은 것으로 나타났으며 배양액과 외부에 흡착칼럼을 이용하여 prodigiosin계 적색색소의 생산성을 증가시킬 수 있었다[2]. 그러나 흡착제가 배양액에 존재하는 균체, 기질로 이용된 카제인 및 생산된 색소에 대해 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서는 연구된 바가 없다.

본 연구는 흡착제를 이용한 색소추출발효에서 이용된 균체와 기질 및 생산된 색소의 흡착특성을 조사하였다.

실험 재료 및 방법

1. 사용균주

충북 음성의 토양에서 직접 분리한 prodigiosin계 적색색소를 생산하는 Serratia sp. KH-95 KFCC-10970[3]은 2 g/L dextrose, 10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 15 g/L agar를 함유한 한천배지를 사용하여 28℃에서 24시간동안 배양 후 15일 간격으로 계대배양하여 4℃에서 냉장보관하여 유지하였다.

2. 배지조성

10.0 g/L Bacto peptone, 2.0 g/L dextrose, 10.0 g/L yeast extract, 2.0 g/L K2HPO4를 종균배지로 이용하여 500 mL Erlenmeyer 플라스크에서 50 mL, 28℃, 200 rpm에서 12시간동안 배양 후 2% (v/v)를 생산배지에 접종하였으며 생산배지의 조성은 30.0 g/L casein, 1.7 g/L K2HPO4, 1.0 g/L MgSO4, 1.0 g/L NaCl 로 초기 pH는 멸균하기 전 7.0으로 조정하였다.

3. 흡착제

Diaion HP-20 수지 (Mitsbuishi)는 순수한 isopropanol에 12시간동안 유지한 후 증류수로 세척하여 121℃에서 20분간 멸균하여 멸균된 증류수에 보관하였다.

4. 분석방법

균체는 분광광도계 (Beckman DU-600)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며 균체 표준곡선을 이용하여 균체농도를 계산하였다. 배양액 및 균체에 함유되어 있는 색소량을 측정하기 위하여 배양액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액과 균체를 분리하였다. 배양액에 있는 색소량은 HCl이 함유된 산성화된 메탄올 (1 N HCl 4 mL + methanol 96 mL)을 이용하여 OD535가 0.3∼0.8되도록 희석한 후 분광광도계를 사용하여 535 nm에서 측정하였다[4]. 균체에 함유되어 있는 색소량을 측정하기 위하여 분리된 균체에 산성화된 메탄올을 가하여 균체에 함유된 색소를 추출한 후 다시 원심분리하여 상등액에 있는 색소를 분광광도계로 535 nm에서 흡광도를 측정하였고, 색소표준곡선을 이용하여 색소농도를 계산하였다. 기질로 이용된 카제인은 Biuret 법[5]으로 310 nm에서 흡광도를 측정하였으며 카제인 표준곡선을 이용하여 카제인 농도를 산출하였다.

결과 및 토의

흡착제를 이용하여 플라스크상에서 in situ 색소 흡착발효에 대한 실험을 하였다. 10% (v/v)의 흡착제를 접종 후 12시간에 첨가하여 흡착제를 첨가하지 않은 배양과 비교하였다. 플라스크에 흡착제를 투입할 경우 초기 3시간동안 균체의 농도가 4.39 g/L에서 3.0 g/L로 감소한 후 서서히 증가하였으며, 흡착제를 넣지 않은 플라스크의 배양액은 6.99 g/L까지 균체가 증가하여 흡착제를 넣은 배양액보다 두 배 높은 균체농도의 차이를 보였다 (Fig. 1.). 색소는 흡착제를 첨가한 후 서서히 감소하다가 15시간 후부터 일정한 농도를 유지하였다 (Fig. 2.).

생산된 총 색소농도는 흡착제를 첨가한 것은 7.84 g/L의 색소가 생산되었으며, 흡착제를 첨가하지 않은 것은 4.78 g/L로서 흡착제 첨가시 64.2%의 색소증가를 확인 할 수 있었다 (Fig. 4.). Fig. 3에서와 같이 기질로 사용된 카제인 농도는 흡착제를 투입 후부터 흡착제를 첨가하지 않은 경우에 비해 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터 카제인 역시 흡착제에 일부 흡착되는 것으로 판단된다.

균체, 색소 및 카제인이 HP-20 수지에 흡착되는 특성을 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 500 mL Erlenmeyer 플라스크에서 색소의 생산이 거의 이루어지지 않는 약 10시간동안 배양한 후 균체의 생장을 막기 위하여 4℃ 냉장고에서 6시간동안 균체를 보관하였다. 균체의 생장과 색소의 생산이 이루어지지 않는 상태에서 10% (v/v) 흡착수지를 넣고 28℃, 120 rpm에서 150분 동안 흡착을 수행한 결과 균체는  HP-20 수지에 흡착되지 않음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5.). 이 결과로부터 색소생산시 흡착제를 넣은 후 균체가 감소한 원인은 균체가 흡착제에 직접 흡착되는 것이 아니라, 균체 외벽에 붙어있는 색소와 함께 흡착제에 흡착되기 때문임을 알 수 있었다. 또한, in situ 색소흡착 흡착에 영향을 미치는 주요요소 중의 하나인 pH 의존성에 대해 알아보았다 (Fig. 6.). 배양액을 pH 7.5∼9.0 범위에서 색소흡착을 수행했을 때, 실험에서 pH가 중성영역으로 갈수록 흡착용량이 크고 알칼리 영역으로 갈수록 흡착용량이 떨어짐을 확인하였다.

참고문헌

1. Kim, C. H., Kim, S. H. and Hong, S.I.: Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.     26, 283 (1998).

2. Kim, C. H.: Ph.D Thesis, Korea Univ., Seoul, Korea (1998).

3. Kim, C. H., Kim, S. W. and Hong, S. I.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 13,       431 (1998).

4. Goldschmidt, M. C. and Williams, R. P.: J. of Bacteriology 96, 609 (1968).

5. Gornall, A. J., Baradawill, C. S., and David M. M.: J. Biol. Chem., 177, 751     (1949).