배양조건 변화가 곤충병원성 선충의 공생 박테리아에 의한

단백질 분해 효소 생성에 미치는 영향

배준상, 최은석, 류근갑

울산대학교 화학공학부

Production of Protease of Symbiotic Bacterium of Entomopathogenic Nematodes

for Culture Conditions

Jun-Sang Bae, Eun-Suk Choi, Keun-Garp Ryu

School of Chemical Engineering, University of Ulsan

서론

곤충병원성 선충은 환경 오염 및 생태계 파괴 등과 같은 문제를 가진 화학 살충제를 대신하기 위한 무공해 생물농약에 이용되고 있다. 곤충병원성 선충은 곤충에 기생하며 병원성이 발현되어 숙주인 해충을 사멸시키는데 넓은 기주 범위와 뛰어난 기주 탐색 능력 및 해충 사멸 능력을 갖고 있다.

곤충병원성 선충에 의한 해충의 파괴는 선충 내에 공생하는 박테리아에 의한 것으로 알려지고 있다(1). 즉, 이들 선충은 내부에 공생 박테리아를 지니고 있으며 기주 내로 침입한 후 분비된 박테리아가 증식하면서 Protease등을 포함하는 Toxin을 생산하여 24시간이내에 기주를 치사시킨다(2). 공생 박테리아는 선충 증식에 필요한 영양분 제공은 물론 다른 미생물의 증식 억제 및 선충 증식에 따른 최적의 조건을 제공해 준다.

Steinernema종의 공생 박테리아인 Xenorhabdus nematophilus는 곤충 유충의 사멸과 소화에 중요한 역할을 하는 생성물을 형성하는데 이 생성물은 Protease와 Lipase를 포함하는 것으로 알려졌다(3). 공생 박테리아의 Phase에 따라 생성물의 양과 종류가 달라지는데 Phase Ⅱ의 공생 박테리아가 Phase Ⅰ의 공생 박테리아 보다 더 적은 양과 보다 더 작은 종류의 생성물을 가지는 것으로 알려져 있으며 Phase Ⅰ의 공생 박테리아가 Phase Ⅱ의 공생 박테리아에 비해 선충의 증식에 보다 좋은 조건을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 공생 박테리아의 Phase Variation은 NBTA 배지에서의 박테리아 배양으로 확인할 수 있다.

본 연구에서는 선충 Steinernema glasrei의 공생 박테리아 Phase Ⅰ Xenorhabdus nematophilus를 액체 배양해 배지 조성과 배양 온도에 따른 Protease의 생성을 관찰하였다.

실험

고체(NBTA) 배양

고체 배양에 사용한 NBTA 배지는 Nutrient Agar(NA)(20 g/L)와 Bromothymol Blue(BTB)(25 □/L), Triphenyltetrazolium Chloride(TTC)(40 □/L)등이 포함된 것으로 Xenorhabdus종의 공생 박테리아를 배양하여 Phase를 확인할 수 있는 배지이다. Phase Ⅰ의 공생 박테리아인 경우는 Colony Color가 Green이 되고 Phase Ⅱ일 때는 Red가 나타난다.

순수한 Phase Ⅰ의 공생 박테리아를 실험에 이용하기 위해 Source Plate에서 Colonies(Green + Red)가 나타나면 Green Colony만을 계속적으로 계대 배양했다. 이때 계대 배양의 주기는 4∼5일로 했으며 배양 온도는 25℃로 했다.

액체 배양

① Seed 배양

NBTA 배지에서 성장중인 Phase Ⅰ의 공생 박테리아를 계대 배양 주기안에     취해서 Yeast extract(5%), NaCl(0.5%), KH2PO4(0.5%)의 액체 배지(Working vol.     50 mL, flask vol. 250 mL)에 접종하여 약 1일간 25℃, 100 rpm incubator에서     배양 한다.

② 본배양

Seed를 Exponential Growth 상태가 될 때까지 배양(약 1일)한 후 그 배양액      2 mL를 본배양 배지(working vol. 50 mL, flask vol. 250 mL)에 접종한다. 본배    양은 배지 조성 및 온도 변화로 나누어 다음과 같이 실험했다.

ⓐ 배지 조성 변화

공생 박테리아의 성장에 필요한 Nitrogen과 Carbon의 Source를 변화시키며       배양했다.

Nitrogen Source로는 Yeast Extract, Tryptone, Peptone, Soytone 그리고 Gelatine      등을 사용하였고 이는 각 배지 조성의 1.5%(0.75 g)를 차지한다. Carbon          Source로는 Glucose, Fructose, Lactose, Maltose등이며 각 배지 조성의 3.0%        (1.50 g)이다. 각 Nitrogen과 Carbon Source를 조합하여 배양하였다.

배양 온도는 25℃이며 100 rpm에서 교반 하였다.

ⓑ 배양 온도 변화

배양 배지를 Soytone(Nitrogen Source)와 Fructose(Carbon Source)로 하고 온도      를 달리하여 배양했다. 각각이 배지 조성에서 차지하는 비율은 1.5%(0.75 g)      과 3.0%(1.50 g)이며 배양 온도는 22℃, 28℃, 31℃, 그리고 처음 24시간은 2      8℃ 에서 배양 그 후는 4℃(냉장)보관 등으로 했다. rpm은 100으로 했다.

모든 본배양 배지는 위에서 언급한 Nitrogen과 Carbon의 Source이외에 공통으    로 NaCl(0.5%)(0.25 g)과 KH2PO4(0.25%)(0.125 g)를 넣어 제조하였다.

③ 분석

Protease는 Schmidt et al.의 방법을 수정하여 분석하였다(4). Hide Powder Azure    (HPA)를 이용하여 배양액의 Protease Activity를 알아 볼 수 있는 방법이다. 먼    저 본배양 배양액을 Sampling해 원심분리 한 다음 그 배양 여액(100 □), HPA    (3 mg), 그리고 Buffer(1 mM CaCl2, 50 mM Tris HCl pH 8.0) 1.4 mL를 혼        합하여 2시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 shaking한 후 원심분리해서 그 여액    의 흡광도를 596 nm에서 측정한다.

결과 및 토론

배지 조성 변화가 Protease 생성에 비치는 영향

Nitrogen Source와 Carbon Source의 조합으로 배지를 제조하여 공생 박테리아 Xenorhabdus nematophilus를 배양해 시간에 따른 Protease 생성을 알아보았다.       Nitrogen Source로 Yeast Extract를 사용했을 경우 모든 Carbon Source에 대해  Protease 생성이 낮았다.<Figure 1.> 또한 Tryptone을 사용했을 때는 Fructose을 제외하고 나머지 Carbon Source에서 비교적 적은 량의 Protease가 생성되었다.<Figure 2.> Peptone을 Nitrogen Source로 사용했을 경우는 Fructose와 Lactose를 각 Carbon Source로 했을 때 비교적 Protease 생성이 많았으나 Glucose가 Carbon Source로 사용된 경우는 Protease 생성이 낮았다.<Figure 3.> 즉, Yeast Extract를 Nitrogen Source로 사용했을 경우 공생 박테리아의 Protease 생성에 적당하지 않은 것으로 나타났고 Fructose를 Carbon Source로 사용하면 Tryptone, Peptone을 Nitrogen Source로서 사용했을 때 Protease 생성이 높았다. 이러한 이유로 높은 Protease 생성을 위한 Xenorhabdus nematophilus 배양 배지의 Carbon Source로 Fructose를 고정하고 이에 알맞은 Nitrogen Source를 찾기 위해 Yeast Extract를 제외한 Nitrogen Source로 Tryptone, Peptone, Soytone, 그리고 Gelatine등을 사용해 배지를 제조하고, 공생 박테리아를 배양해 Protease의 생성을 측정하였다. 이 실험 결과에서 Nitrogen Source로 Tryptone 혹은 Soytone을 사용했을 때 Protease 생성이 높았다.<Figure 4.>

이로써 높은 Protease 생성을 위한 Phase Ⅰ의 Xenorhabdus nematophilus의 배양에 필요한 배지의 Nitrogen Source로는 Tryptone 또는 Soytone이 적당한 것으로 생각되며 Carbone Source로는 Fructose가 알맞은 것으로 사료된다.

배양 온도 변화가 Protease 생성에 미치는 영향

위의 실험 결과로 Nitrogen과 Carbon Source 배지로서 각각 Soytone과 Fructose의 배양 온도를 변화시켰을 때 Protease 생성의 변화에 대해 알아보았다. Nitrogen Source로 Soytone을 사용하고 Carbon Source로는 Fructose를 사용해 22℃, 28℃, 그리고 31℃에서 배양한 결과 22℃에서 비교적 높은 Protease 나타내었고 초기에 28℃에서 24시간 배양한 후 4℃(냉장)에서 보관한 것은 냉장 보관 직전의 Protease 양을 적어도 96시간 이상까지 유지하였다.<Figure 5.>

이상의 결론으로 곤충병원성 선충의 공생 박테리아인 Xenorhabdus nematophilus (Phase Ⅰ)의 Protease 생성 배양에 있어서 Nitrogen Source로 Tryptone 또는 Soytone이, Carbon Source로는 Fructose가 좋은 결과를 보였고 배양 온도는 22℃가 가장 알맞은 것으로 나타났다. 그리고 생성된 Protease는 열 안정성이 약한 것을 알았다.

거의 모든 배양에서 나타난 공통적인 특징으로 Protease의 최고 농도는 배양 시작 후 24∼48시간 사이에 나타났다.

참고문헌

1. Poinar, G. O. Jr. (1983), The Natural History of Nematodes, Prentice-Hall, Engle-   wood Cliffs.

2. Kaya, H. K., R. A. Bedding, and R. J. Akhurst (1993), An Overview of Insect-    parasitic and Entomopathogenic Nematodes, In; Nematodes and Biological Control of   Insect Pets, (R. A. Bedding, R. J. Akhurst, and H. K. Kaya, eds.)., CSIRO, Austr-   alia.

3. G. B. Leisman, J. Waukau, and S. A. Forst (1995), Characterization and Environ-   mental Regulation of Outer Membrane Proteins in Xenorhabdus nematophilus, AppL.   Environ. Microbiol., 61, 200-204.

4. T. M. Schmidt, B. Bleakley, and K. H. Nealson (1998), Characterization of an E-   xtracellular Protease from the Insect Pathogen Xenorhabdus luminescens, Appl.        Environ. Microbiol., 54, 2794.