교반조 발효기와 공기부양 발효기 내에서의 Phellinus linteus의 배양

이창우, 최근호

대전산업대학교 화학공학과

Cultivations of Phellinus linteus in a Stirred Tank Fermentor and an Airlift Fermentor

Chang Woo Lee, Keun Ho Choi

Department of Chemical Engineering, Taejon National University of Technology

서론

새로운 항종양성 물질(antitumor substances)의 개발이라는 측면에서 담자균류로부터 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류(polysaccharides)를 얻기 위한 연구가 진행되어 왔다. 표고버섯(Lentinus edodes)과 팽이버섯(Flamulina velutipes) 그리고 구름버섯(Coriolus versicolor)을 포함하는 십여 종의 버섯이 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류를 갖고 있으며, 그러한 버섯으로부터 얻을 수 있는 항암효력과 면역 조절 효력을 갖는 다당류 중에서도 뜨거운 물과 알코올을 사용하여 상황(Phellinus linteus)의 균사체로부터 추출한 다당류가 쥐에 이식한 육종(sarcoma-180)에 대해 가장 효과적인 것으로 보고되고 있다[1]. 그러나, Phellinus linteus의 자실체는 자연적으로 구하기가 대단히 어려워서 균사체를 인공적으로 액체배양하여 항암물질을 생산하고자 하는 노력[2,3]이 있어 왔다.

Phellinus linteus 균사체의 대량 배양을 통하여 항암물질인 다당류를 경제적으로 생산하기 위해서는 최적 배지의 개발과 적합한 생물반응기의 선정 그리고 최적 배양조건의 확립이 필요하다. 따라서, 본 연구에서는 Phellinus linteus 균사체의 대량 배양에 적합한 생물반응기의 선정 그리고 최적 배양조건의 확립을 위하여 교반조 발효기와 공기부양 발효기에서 각각 Phellinus linteus 균사를 액체 배양함으로써 두 개의 발효기의 성능을 비교하는 한편, Phellinus linteus 균사의 액체 배양에 대해 공기유속과 전단응력이 미치는 영향을 연구하였다.

실험

본 연구에서는 Phellinus linteus KCTC 0082BP 균주를 (주)한국신약으로부터 분양을 받아서 사용하였다. 백금이를 사용하여 PDA(potato dextrose agar) 배지 20 mL가 든 Petri dish의 중심부에 Phellinus linteus 균주를 접종하여 균사가 만연할 때까지(약 10일간) 배양기내(28±1 ℃)에서 배양한 다음에 균사가 만연한 Petri dish를 냉장고(4 ℃)에 보존하였다. 종균용 배지로는 이 등[2]의 연구에서 가장 좋은 균사 성장을 보여주는 것으로 밝혀진 GP배지를 사용하였다. 내경이 7 mm인 cork borer를 사용하여 냉장고에 보존중인 Petri dish로부터 균사가 자라고 있는 고체배지 조각을 떼어서 100 mL 종균용 배지에 접종하여 배양하였다.

액체배양용 배지는 증류수 1 L당에 glucose 90 g, peptone 10g, yeast extract 3.0 g, K2HPO4 0.7 g, MgSO4·7H2O 1.0 g 그리고 CaCl2 0.1 g 를 녹여서 제조하였다. 또한, 액체배양 시에 접종되는 균체의 양을 일정하게 유지하기 위하여, 자외선분광광도계(Spectronic 20D, Milton Roy Company)를 사용하여 종균배양액의 투광도와 건조균체량간의 관계를 구하였으며, 그 관계를 이용해서 건조균체농도가 1 mg/L가 되도록 일정량의 종균배양액을 취해서 미리 조제하여 멸균한 액체 배지가 들어 있는 발효기에 접종하여 배양하였다. 각 실험에 사용한 배지와 종균용 배지는 먼저 배지의 pH를 0.1 N NaOH 용액과 0.1 N HCl 용액을 사용하여 5로 조정한 후에 고압멸균기에 넣어서 121 ℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 발효기는 28±1 ℃에서 운전하였으며, 3일간 배양하였다.

액체배양을 시작하여 일정한 시간에 도달하는 시점(6시간후, 18시간후, 24시간후, 30시간후, 42시간후, 48시간후, 54시간후, 66시간후, 72시간후)에서 각각 배양액 시료 10 mL를 취하여 튜브에 넣고 3000 rpm으로 15분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하고 가라앉아 있는 균체에 증류수 10 mL를 가하고 같은 조건에서 원심분리하였다. 이런 과정을 한 번 더 수행한 후에 균사체가 들어 있는 튜브를 온도가 100±1 ℃로 유지되고 있는 건조기에 넣어서 48시간동안 건조시킨 다음에 식혀서 튜브의 무게를 측정하여 건조균체량을 구하였다.

실험결과 및 토의

Phellinus linteus 균사의 액체 배양에 대한 공기유속과 전단응력이 미치는 영향에 대한 실험은 5 L 용량의 교반조 발효기를 사용하여 수행하였다. 이때의 교반조발효기의 운전부피(working volume)는 2.2 L였다.

Fig. 1은 시간의 증가에 따른 건조균체량의 변화를 공기속도의 함수로 나타낸 것이다. 삼각플라스크내의 액체부피는 500mL였다. 삼각플라스크나 교반조발효기의 구분없이 건조균체량은 시간이 증가할수록 초기에는 급격히 증가(1단계, 1차 성장기)하였다가 거의 일정하게 유지되거나 약간 감소(2단계)하다가 다시 증가(3단계, 2차 성장기)하였다가 배양의 마지막 단계에서는 다시 감소(4단계)하는 경향을 보여주었다. 이는 Phellinus linteus의 회분식 액체배양인 경우 배양단계를 크게 4단계로 나눌 수 있음을 의미한다. 후각과 pH의 측정결과로 미루어 볼 때에 균사체가 성장하는 동안에 포도당이 점차 알콜과 산과 같은 물질로 변화함을 알 수 있었다. 즉, 어느 정도 적응기(2단계)를 거쳐야만 알코올과 산도 영양원으로 사용하여 성장할 수 있기 때문에 그러한 4단계가 존재한다고 추측해 볼 수 있다. 한편, 공기속도가 증가할수록 최종 건조균체량과 최대균체량 모두가 증가하였다. 그리고, 강제적인 공기의 유입이 없는 삼각플라스크인 경우에는 초기를 제외한 다른 기간동안에 용존산소농도가 교반조 발효조에 비해서 낮기 때문에 건조균체량이 교반조 발효조의 경우에 비해 상당히 작았다.

Fig. 2은 시간의 증가에 따른 용존산소농도의 변화를 공기속도의 함수로 나타낸 것이다. 용존산소농도 역시 4단계로 변화하였다. 초기의 서서히 감소하는 1단계와 그 이후에 급격히 감소하는 2단계 그리고 급격히 상승하는 3단계를 거친 후에 어느 정도의 폭을 가지고 증가하였다가 감소하기도 하지만 전체적으로는 점차 감소하는 4단계를 거치면서 변화하였다. 공기유속이 4 L/min인 경우에는 4단계의 경향이 비교적 뚜렷하나 공기유속이 이보다 적은 경우에는 4단계에서 용존산소농도가 급격히 증가했다가 영으로 감소하였는데 이는 용존산소농도의 최종값으로 예상한데로 전극의 멤브레인 부분이 균체에 의해 막히는 현상이 일어났기 때문이었다. 공기속도가 증가할수록 배양의 1∼3단계 동안에 용존산소농도는 큰 값을 보여주었다. 시간에 따른 pH의 변화경향은 시간에 따른 용존산소농도의 변화경향과 거의 유사(Fig. 3)하나 pH의 변화가 용존산소농도의 변화에 비해 지연되어 나타난다고 볼 수 있었다.

Fig. 4는 시간의 증가에 따른 포도당농도의 변화에 대한 공기속도의 영향을 보여주고 있다. 균체가 성장하면서 포도당을 탄소원으로 사용하므로 포도당 농도는 공기속도의 값에는 상관없이 시간이 증가할수록 점차 감소하였다. 그리고, 포도당 농도의 변화에 대한 공기속도의 영향은 분명하지 않았다.

Fig. 5는 시간의 증가에 따른 건조균체량의 변화에 대한 교반기의 회전속도의 영향을 보여주고 있다. 교반기의 회전속도를 200 rpm, 300 rpm 그리고 400 rpm으로 변화시켰더니, 최대 건조균체량은 300 rpm일 때에 얻어졌다. 교반기의 회전속도를 증가시키면 기체분산기에서 발생된 기포가 보다 작게 분쇄되어 기-액 계면적이 증가할 뿐만 아니라 혼합성능의 향상으로 기포가 발효기 내부에 고루 분산되므로 산소전달속도가 증가할 것이다. 따라서, 교반기의 회전속도가 증가할수록 용존산소농도는 증가하였다. 특히, 교반기의 회전수가 400 rpm일 때의 경우는 2단계 이후에 다른 회전수일 때보다 균체농도도 낮기 때문에 상당히 높은 용존산소농도를 보여주었다. 그럼에도 불구하고 교반기 회전수가 300 rpm일 때 최대 건조균체량이 얻어진 것은 Phellinus linteus 균사체인 경우에도 교반기의 회전속도를 일정한 값 이상으로 증가시키면 전단응력의 영향을 받아서 성장이 느려진다는 것을 의미한다. 한편, 시간의 증가에 따른 포도당농도의 변화에 대한 교반기의 회전속도의 영향을 무시할만하였다.

본 연구에서는 교반조 발효기와 공기부양발효기를 비교하기 위하여 운전부피를 3.5 L로 그리고 공기속도를 3.5 L/min로 동일하게 유지하면서 배양실험을 수행하였다. 이때, 교반기의 회전속도는 300 rpm였다. Fig. 6은 건조균체량에 대한 반응기의 형태의 영향을 보여 주고 있다. 공기부양발효기에 비하여 교반조발효기에서 더 큰 건조균체량을 얻을 수 있었다. 이것은 교반조 발효기가 공기부양 발효기에 비하여 산소전달성능이 높으며 Phellinus linteus 균사는 전단응력에 크게 민감하지 않기 때문이다.

한편, 공기부양발효조에 비해 교반조발효기의 산소전달성능이 우수하기 때문에 교반조발효기내의 용존산소농도는 대부분의 배양기간 동안에 공기부양발효조내의 용존산소농도보다 크게 유지되었다. 그리고, 전체 배양기간동안에 교반조발효기내의 건조균체농도가 공기부양발효조내의 건조균체농도보다 높기 때문에 교반조발효기의 포도당농도가 보다 빨리 감소하였다.

참고문헌

1.	Ikekawa, T., M. Nakanishi, N. Uehara, G. Chihara, and F. Fukuoka: Gann, 59, 155(1968).

2.	Lee, J. H., S. M. Cho, K. S. Ko, and I. D. Yoo: Kor. J. Mycol., 23, 325(1995).

3.	정경수, 고경수, 한만우: 한국 특허공보 97-9150(1997).