Toluene을 분해하는 Burkholderia cepacia SKK381의 분리

강동일, 김진욱, 고창웅*, 김남기

성균관대학교 공과대학 화학공학과, 삼척대학교 공과대학 화학공학과*

Isolation of Burkholderia cepacia SKK381 degrading toluene

Dong-Il Kang, Jin-Yook Kim, Chang-Ung Ko*, Nam-Ki Kim

Dept. of Chem. Eng., Sungkyunkwan University,

Dept. of Chem. Eng., Samchuk University*

서론

톨루엔은 매우 독성이 강한 유기용매로서 0.1%의 농도에서 대부분의 미생물은 죽게 된다. 그로인해 toluene은 미생물을 멸균하는데 사용되기도 하며, 세포막에 있는 지질을 추출하는데 효과적이어서 다양한 효소의 분석에 이용되고 있다. 그리고 benzene, xylene과 함께 여러 산업분야에서 다용하게 사용되고 있다. 본 연구에서는 방향족 화합물이 포함된 토양의 생물학적처리(Bioremediation)에 이용할 미생물을 확보하기 위하여 토양의 균원시료로부터 toluene을 분해하는 미생물을 분리한 후 우수한 균주를 선별·동정하였고, 그 생육특성을 알아보았다.

실험

배지 및 시약

Toluene 분해균주의 분리 및 배양에 사용한 최소배지는 증류수 1□중에 NH4Cl 1g, K2HPO4 4.35g, NaH2PO4 3.9g, MgSO4·7H2O 0.38g, CaCl2 0.03g, H3BO3 2.86g, MnCl2·4H2O 1.81g, ZnSO4 0.222g, Na2MoO4·2H2O 0.39g, CuSO4·5H2O 0.079g, Co(NO3)2·6H2O 49.4□이며 pH는 7.0으로 조절하였다. 유일한 탄소원인 toluene은 멸균된 최소배지에 첨가하였다. 균주의 분리 및 보관을 위한 완전배지는 Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 8g, 증류수 1□를 사용하였으며, 평판 고체배지는 상기 배지에 Agar를 1.5%(w/v)농도로 첨가하여 사용하였다.

균주분리 및 선별

서울 근교의 토양의 균원시료를 멸균된 증류수로 희석한 후 희석액을 유일 탄소원으로 toluene을 함유한 액체 최소배지에 접종, 배양하였다. 이 배양액을 분리원으로 하여 3회에 걸쳐 24시간 간격으로 enrichment culture를 수행한 후 배양액을 희석하여 고체배지에 도말하여 colony를 순수분리하였다. 순수분리된 균주를 액체 최소배지에 toluene을 1500ppm(w/v) 농도로 첨가한 후 배양하여 균체증식과 분해능이 높은 균주를 최종 선발하였다. 이때 toluene의 휘발을 방지하기 위하여 silicone rubber로 flask 입구를 막았다.

균주의 배양

분리균주를 toluene이 첨가된 최소배지에서 2번에 나누어 24시간 배양하여 활성화 시킨 후 종균으로 사용하였으며, toluene 1500ppm이 첨가된 최소배지 50□에 전배양액을 10%(v/v)가 되게 접종하고, 초기 O.D.를 0.08로 일정하게 유지하여 접종하였으며, 30℃, 150rpm으로 진탕배양하면서 배양시간에 따른 균체증식, pH 변화, 기질의 농도를 조사하였다. 균체증식은 배양액을 취하여 UV spectrophotometer를 사용하여 640nm에서 배양액의 흡광도로 나타내었다.

균주의 동정

분리균주의 동정은 형태적, 생리적 및 생화학적 특성을 조사한 후 Bergey's manual of determinative bacteriology(8th ed.)와 Manual for the identification of medical bacteria(2nd ed.)에 따라서 실시하였다.

Toluene의 분석

배양액내의 용존 toluene의 정량을 위하여 배양액 일정량을 Membrane filter(pore size, 0.45□)로 여과하고, Dichlorobenzene으로 추출하여 Calcium chloride로 수분을 제거한 후 Gas chromatography로 분석하였다.

결과 및 토론

Toluene 분해균주의 분리

총 39개의 토양 시료중에서 toluene을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 균주를 분리하여 생육이 우수한 균주를 분리하였다. 특히 분리균주 Burkholderia cepacia SKK381은 최소배지에서 40시간 배양시 O.D.값이 1.147로 분리균주 중에서 생육이 가장 좋고 toluene 자화능이 우수하여 최종균주로 선정하였다.

균주의 동정

분리균주 Burkholderia cepacia SKK381의 전자현미경 사진은 Fig. 1.과 같으며, 형태적, 생리화학적 특성을 조사한 결과는 Table. 1.에 나타내었다. 본 균주는 간균의 호기성 세균으로서 운동성이 있는 Gram 음성균으로 Oxidase와 Catalase는 양성, Glucose 이용시 산을 형성하지 않았으며, Carbohydrate의 O/F반응은 둘다 양성 반응을 보이는 특징을 나타내었다. 이러한 결과로 이 균체는 Burkholderia cepacia 와 거의 비슷한 것으로 나타났으며, 따라서 상기 형태적, 생화학적 특성에 의한 균주 동정결과, Burkholderia cepacia SKK381이라고 명명하였다.

Table. 1. Morphological and biochemical characteristics of the isolated strain SKK381

Characteristics	SKK381	Characteristics	SKK381
Shape	rod	Gelatine hydrolysis	-
Size	0.8∼1.0 × 1.5∼3.0□	PNPG(p-nitro-phenyl-□D-galactopyranoside	+
Gram stain	-
		Glucose	+
Motility	+	Arabinose	+
Catalase	+	Monnose	+
Oxidase	+	Mannitol	-
O/F test	Oxidation	N-acetyl-glucosamine	-
		Maltose	-
Denitrification	-	Gluconate	+
Nitrate used as a nitrogen source	+	Caprate	+
Indole production	-	Adipate	+
Glucose acidification	-	Malate	+
Arginin dehydrolase	-	Citrate	+
Urease	-	Phenyl-acetate	+
Esculin hydrolysis	+

분리균주의 생육 곡선

Toluene을 유일 탄소원으로 첨가한 최소배지에서 배양시간에 따른 분리균주의 균생육 및 기질의 농도변화를 Fig. 2.에 나타내었다. Burkholderia cepacia SKK381은 유도기가 거의 없이 급격한 균체증식을 나타내었으며, 배양후 12시간만에 toluene이 배양액에서 검출되지 않았다. 배양 후 28시간에서는 O.D.가 1.147로 최대의 균체량을 나타내며 정지기에 도달하면서 pH는 6.66으로 감소하였다. Burkholderia cepacia SKK381의 생육 최적온도를 알아보기 위하여 최소배지에 각 온도별로 40시간 배양한 결과 Fig. 3.과 같은 결과를 얻었다. 이 결과에 의한 최적 온도는 30℃였다.

참고문헌

1. 이창호, 오희목, 권태종, 안성구, 권기석, 고영희, 윤병대, 1994. Toluene을 분해    하는 Acinetobacter sp. GEM63의 분리 및 특성. KOR. JOUR. MICROBIOL.    32. 329∼335.

2. 김성빈, 1996. Candida tropicalis PW-51을 이용한 페놀분해와 페놀수지 폐수    의 처리. 충북대 석사학위논문.

3. 이승우, 이준명, 장덕진, 1998. Pseudomonas F1과 Burkholderia cepacia G4에     의한 BTEX, trichloroethylene의 분해. 한국생물공학회지. 13. 561∼568.

4. 김경태, 1999. Pseudomonas fluorescens KCTC1767에 의한 Toluene의 제거.     성균관대 석사학위논문.

Fig. 2. Time course of cell growth and pH by Burkholderia  cepacia SKK381 in a minimal medium containning toluene as a sole source.

Fig. 1. Scanning electron microscopic photogram of the isolate SKK381 cultured on LB medium for 24 hours.

Fig. 3. Effect of temperature on growth of Burkholderia cepacia SKK381