공중합 수식 셀룰라아제의 당화 및 흡착특성에 관한 연구

한지윤, 박귀남, 박진원

연세대학교 화학공학과

Saccharification and adsorption characteristics

of modified cellulase with  a copolymer

Han, J.Y., Park, K.N., Park, J.W.

Department of Chemical Engineering, Yonsei University

서론

지구상에서 가장 풍부한 물질 중의 하나인 셀룰로오스의 당화 공정은 폐셀룰로오스계 물질의 재활용과 화석연료의 대체물질개발의 측면에서 최근 주목받고 있다. 산당화공정은 부식, 공해 등의 문제점과 불필요한 부산물의 생성 등과 같은 문제점이 있는 반면, 온화한 조건의 온도, 압력에서 반응이 일어나는 효소당화 공정은 높은 활성의 효소가 개발되면서 그에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 실제로 섬유질 바이오매스인 셀룰로오스의 효소가수분해공정은 효소기질 반응에 의한 당생성속도가 느린 점과 효소-기질과의 흡착에 의한 효소 실활이 급속히 진행된다는 점등과 같은 반응공학적인 문제와 아직까지 가수분해효소의 생산가격이 비싼 경제적인 문제가 있다.

본 연구는 셀룰라아제의 반응성을 향상시키기 위하여 셀룰라아제를 공중합 고분자와 중합시켰고, 이를 폐신문지 당화반응에 적용하여 당화특성 및 흡착특성을 고찰하였다.

실험재료 및 실험방법

(1) 수식셀룰라아제의 제조

본 실험에 사용한 셀룰라아제는 Tricoderma viride에서 생산된 국내산 셀룰라아제인 cellulase C(태평양(주))이다. 셀룰라아제의 활성도의 단위는 FPase 활성도로 나타내었는데, 50℃, pH 5.0에서 1분 동안에 1□mol의 생성환원당을 생산하는 효소량을 1Unit로 정의하였다. 표준 당화기질로서는 여과지 FP-5C(Toyo Roshi Ltd. Japan)를 사용하였으며 셀룰라아제의 활성은 391Unit/g이었다. 환원당농도 측정은 dinitro salicylic(DNS) acid 발색법을 사용하였다. 수식을 위한 공중합체는 일본의 Nippon Oil & Fats사의 제품으로 Polyoxyethylene (POE) 유도체와 Maleic Acid Anhydride(MAA)의 공중합체로서 그 구조는 Fig.1과 같다. 수식반응은 셀룰라아제의 아미노기와 MAA이 결합하는 말레일화 반응(maleylation)에 의한 것으로, Kajiuchi & Park의 방법을 사용하여 수식 셀룰라아제를 제조하였다. 수식은 pH 8.0∼8.2, 온도 0∼4℃에서 수식 반응액의 pH값이 불변인 시점을 수식 반응 종결시점으로 하였다. 반응이 진행됨에 따라 H+가 생성되어 pH가 감소하므로 염기(0.3∼0.5N NaOH)에 의한 pH 조절이 필요하다. 각각의 수식셀룰라아제의 아미노기 농도는 trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)법으로 측정하였으며 수식률(DM)의 정의는 다음과 같다.

unmodified NH2 of modified cellulase

DM = 1 - ――――――――――――――――――――

total NH2 of native cellulase

	AKM-0530	AKM-1015	AKM-1511	AKM-2010
n	9	13	30	44
k	30	14	10	10
MW	18,000	14,500	16,000	21,500

□                         □

□ -□CH□□CH2□□CH□□CH□□	□

□   □          □    □	□

□   CH2    OＡC    CＡO	□

□   □           □  □	□

□   O            O	□

□   □	□      ( n : ethylene oxide 수,

□  (CH2CH2O)n	□        k : 공중합도)

□           □	□

□          CH3	□

□                         □  k

Fig 1. Characteristics of synthetic copolymers.

(2) 당화반응

당화반응에 사용된 수식셀룰라아제는 셀룰라아제와 네 가지의 공중합고분자를 1:4의 비율로 하여 수식시킨 것이고, 기질은 폐신문지(KOREA TIMES)로서 0.4M 아세트산 완충용액과 섞어 mixer로 1분간 분쇄하여 기계적으로 전처리하였다. 당화반응장치는 회분식으로 전체 반응액의 부피는 400ml이고, air shaker를 사용하여 교반속도 300rpm, 온도 50℃, pH 5.0의 일정한 반응 조건에서 당화반응을 행하였다.

생성된 환원당농도는 DNS 발색법으로 측정하였고, 효소량은 GPC(Gel Permeation  Chromatography)법을 사용하여 측정하였다. 사용한 column은 TOSOH(Japan)의 TSK-GUARD COLUMN SW(7.5*75), TSK-GEL G3000SW(7.5*300) column으로 구성되어 있고, 용리액(1/15M Na2HPO4와 1/15M KH2PO4로 제조한 pH 7.0의 0.1M 인산 완충용액) 유속은 0.8□/min, 검출기(UV) 파장은 280nm이며 온도는 조절하지 않았다.

결과 및 고찰

(1) 수식셀룰라아제의 수식률 및 활성

AKM0531, 1015, 1511, 2010의 네 가지 공중합 고분자/셀룰라아제의 질량비를 1∼6까지 변화시키면서 수식반응을 시킨  결과, 질량비 4이상에서는 공중합 고분자의 종류에 관계없이 최대 수식률의 수식 셀룰라아제가 얻어졌으며 최대 수식률은 고분자에 따라 조금씩 변화하나 거의 50∼60%를 나타내었다. 한편 잔존 활성은 수식률이 증가할수록 서서히 감소하였으나, 항상 75% 이상의 잔존 활성을 보존하였다.

(2) 수식셀룰라아제의 당화반응

기질농도를 0.25%로 일정하게 고정시키고 효소농도를 0.005%, 0.0125%, 0.025%로 변화시켰을 때(각각의 E/S=0.02, 0.05, 0.2=1) 시간에 따른 환원당생성은 Fig 3.과 같다. E/S(Enzyme/Substrate)=0.1일 때, 반응 초기에는 미수식셀룰라아제의 기질 당화율이 수식셀룰라아제의 경우보다 높았으나 반응시간 24시간에서 미수식셀룰라아제의 생성 환원당 농도는 3.57g/L로 수식셀룰라아제의 환원당생성량이 약 3% 많았다.

반응시간이 경과할수록, 생성물 억제작용, 셀룰라아제의 실활 등으로 기질의 당화속도는 감소하나 수식셀룰라아제는 반응조건에 높은 내성을 가지므로 높은 기질 전환율을 나타낸 것으로 사료된다.

Fig 2. Degree of modification and       Fig 3. Glucose concentration vs. time.

relative activity vs. weight ratio          (Substrate concentration=0.25%,

of copolymer modifier to cellulase.        AKM1511 modified cellulase)

E/S=0.1로 고정한 후 미수식셀룰라아제, 네 종류의 고분자로 각각 수식한 AKM 시리즈 수식셀룰라아제의 당화반응을 행한 결과를 Fig 4.(a)에 나타내었다. 반응시간 10시간 후의 미수식셀룰라아제의 생성환원당농도는 1.97g/L, AKM0531 수식셀룰라아제는 1.90g/L로 미수식효소보다 약간 낮았고, AKM1015 수식셀룰라아제는 2.05g/L, AKM1511 수식셀룰라아제는 2.08g/L, AKM2010 수식셀룰라아제는 2.46g/L로 미수식셀룰라아제보다 높은 생성환원당농도를 나타냄을 볼 수 있다. 즉, ethylene oxide(EO)수가 증가함에 따라 생성환원당 농도도 증가하는 결과를 나타내었다.

당화반응 중 기질에 대한 효소의 흡착경향을 Fig 4.(b)에 나타내었다. 효소흡착량은 초기효소량(E0)에 대한 유리효소량(Ef)의 비로 나타내었다. 당화반응이 진행됨에 따라 Ef/E0값은 2시간까지는 급속하게 감소하지만 약 5-8 시간 경과 후에는 다시 약간의 증가세를 보임을 알 수 있다. 이는 반응 초기에 기질에 빠른 속도로 흡착된 효소가 당화반응시간이 증가함에 따라 일정시간 후에 탈착됨을 의미한다.

(a)                                  (b)

Fig 4. (a) Glucose concentration and (b) relative free enzyme concentration(Ef : free enzyme concentration, E0 : initial enzyme concentration) vs. reaction time. (Substrate concentration=0.25%, Enzyme concentration=0.025%, 50℃, pH 5.)

References

1. Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.

2. Habeeb, A. F. S. F. 1966. Determination of free amino groups in protein by trinitrobenzene sulfonic acid. Anal. Biochem. 14: 328-336.

3. Park, J. W. and Kajiuchi, T. 1995. Development of effective modified cellulase for cellulose hydrolysis process. Biotechnology and bioengineering. 45: 366-373.

4. William, E. K., Mark T. H. 1998. Benefits from tween during enzymic hydrolysis of corn stover. Biotech. and Bioeng. 59(4): 420-427.

5. B. Lamech Rad and R. Yazanparast. 1998. Desorption of the cellulase systems of Trichoderma reesei and a Botrytis sp. from Avicel. Biotech. Tech. 12(9): 693-696.