AOT-역미셀계를 이용한 lipase의 역추출에 미치는 알코올의 첨가 영향

최진성, 이봉국, 이은주, 김종화*, 이성식

동아대학교 화학공학과

창원대학교 공업화학과*

Effect of Alcohols Addition on Back-extraction of lipase

Using AOT-Reverse Micellar Systems

Jin-Sung Choi, Bong-Kuk Lee, Eun-Joo Lee, Jong-Hwa Kim*, Sung-Sik Lee

Dept. of Chem. Eng., Dong-A Univ., 840 Hadan-dong, Pusan

Dept. of Chem. Tech., Changwon National University*

1. 서  론

단백질이 역미셀내에 가용화될 수 있다는 사실이 발견된 이후, 역미셀계를 이용한 단백질의 추출과 효소 반응에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 역미셀에 의한 단백질의 분리는 일반적으로 수상의 pH, 이온 강도 그리고 염의 종류 등과 유기상의 계면활성제의 종류와 농도, 보조 계면활성제의 유, 무, 용매의 종류 등에 영향을 받는다. 이들 다양한 인자들 중에서, pH와 이온 강도는 역미셀 추출 공정에 있어서 지배적인 인자이다. 이들 파라미터 외에도 단백질과 미셀간의 정전기적, 소수적 그리고 구조적 상호작용 등이 역추출율에 영향을 미친다. 이들 상호작용 중에서 특히, 정전기적 상호작용은 정추출 과정에서 주된 추진력으로 받아들여지고 있다. 그러나 정추출 보다는 역추출 공정이 상대적으로 어렵다. 그 원인으로는 단백질 또는 효소가 AOT-역미셀과의 불특정 상호작용으로 인해 비가역적으로 변성하거나 활성을 잃기 때문이다. 그리고 이러한 불특정 상호작용에 의한 효소의 변성 및 단백질의 구조 변화가 역미셀 추출 공정에서 역추출율과 역추출 속도를 현저히 감소시킨다. 그러므로 역미셀을 이용한 단백질의 고순도 분리 시, 앞에서 열거한 역추출 공정의 문제점들 중에서 역추출율과 활성 수율에 결정적인 영향을 미치는 미셀-단백질 및 미셀-미셀간 상호작용의 감소를 위한 많은 연구가 필요하다. Dungan 등은 미셀-미셀간 상호작용에 의한 미셀 클러스터(micellar cluster) 형성이 역추출율 감소의 중요한 인자임을 밝혔다. Yamada 등은 미셀-단백질, 미셀-미셀간 상호작용의 제어를 위하여 합성 비이온성 계면활성제(예, Triton, Tween) 또는 생체 계면활성제인 lecithin을 첨가한 혼합 역미셀이 효소와 단백질의 높은 안정성과 선택적인 추출을 나타냄을 발표하였다. 즉 역미셀을 이용한 단백질의 역추출 공정시 역미셀 계면의 특성을 개량하기 위해 간단한 보조 계면활성제(cosurfactant)를 이용한다면 목적 단백질을 고순도, 고활성을 유지할 뿐만 아니라, 선택적인 대량 생산이 가능함을 알 수 있다. 양친매성을 가지고 있는 알코올 분자는 역미셀과 같은 나노 자기 집합체의 계면을 제어할 수 있는 좋은 보조 계면활성제의 특성을 가지고 있다. 알코올 및 지방산 분자들은 구조가 간단하고 가격이 저렴하며, 종류가 다양하다. 또한 알코올 분자의 사슬들은 지질막의 원료가 된다는 연관성, 그리고 생체계로부터의 제거와 재위용이 용이하다는 점등의 많은 장점을 가지고 있다.

본 연구에서는 AOT-역미셀계를 이용한 단백질 역추출시 문제점 중의 하나인 미셀-미셀간 상호작용의 제어를 위한 보조 계면활성제로서 알코올이 lipase의 역추출 거동과 활성 수율에 미치는 영향에 대하여 검토 하였다.

2. 실  험

2.1 시 료

Waco Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 95）의 AOT(sodium di[2-ethylhexyl] sulfosuccinate)를 구입하여 정제 없이 그대로 사용하였다. Lipase (MW=53kDa, pI=4.3) from candida cylindracea는 Sigma (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다. 그리고, propanol (PrOH), butanol (BuOH), pentanol (PenOH), hexanol (HexOH), octanol (Octanol), 2,2,2-Trifluoroethanol (TFE)와1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-pro

panol (HFIP)는 Waco Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다.

2.2 lipase의 역추출

단백질들은 주입법으로 AOT/isooctane 용액에 가용화하였다. 100□M의 단백질을 포함하고 있는 완충용액을 함수율 20으로 일정하게하여 AOT/isooctane 용액에 주입한 다음, 투명한 용액이 될 때까지 강하게 교반한다. 단백질이 가용화되어 있는 역미셀 용액과 0.1M의 염을 포함하고 있는 완충용액을 추출 평형에 도달하는 4시간까지 접촉시켜 역미셀로부터 단백질을 역추출시킨다. AOT-알코올 혼합 역미셀계에 대해서도 같은 방법으로 실험하였다. 단백질의 농도는 280nm에서 분광법 (UV-1600A, Shimadzu)으로 분석한다.

2.3 역미셀에서의 lipase 활성 변화의 측정

AOT 역미셀계에서의 lipase의 활성은 올리브 오일의 가수분해로 측정하였다. lipase와 올리브 오일의 농도는 각각 2mg/L와 5v/v）로 하였다. 본 실험에 이용된 지방산의 농도는 Lowry's법에 의해 결정한다. 이 실험은 lipase가 최고의 활성 수율을 가지는 최적의 함수율 (Wo=7)에서 실시하였으며, 알코올 분자를 농도별로 첨가된 혼합 역미셀에 대해서도 같은 방법으로 lipase의 활성 변화를 조사하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 C.C.lipase의 역추출

염을 함유하지 않은 수상 (pHinj6)에 녹인 lipase를 유기상에 가용화한 후, KCl의 농도가 0.1M인 새로운 수상 (pHaq6)과 접촉시켜 역추출 실험을 하였다. Fig.1은 C.C.lipase의 역추출율 변화에 미치는 알코올의 첨가 효과를 나타내고 있다. Fig.1에서 알 수 있듯이 lipase의 역추출은 역미셀계에 첨가된 알코올의 종류와 농도에 따라 다양한 역추출 거동을 보이고 있다. HexOH과 OctOH의 경우는 농도의 증가에 따라 역추출율이 증가하는 반면, PrOH의 경우는 농도의 증가에 따라 역추출율이 감소하고 있다. 그리고 TFE와 HFIP 첨가의 경우에는 농도가 낮을 경우에는 역추출율이 증가하지만 높은 농도에서는 오히려 역추출율이 감소하는 경향을 보이고 있다. 단백질의 역추출 거동에 미치는 알코올의 첨가 효과를 명확히 하기위해 알코올의 미셀간 상호작용 파라미터 □t를 고려하였다. 역추출율 (Eb)은 아래 식과 같이 첨가한 알코올의 농도 (CAl)와 미셀간 상호작용 파라미터 □t의  함수로 나타낼 수 있다.

Fig.1 Effect of alcohols addition on the back-extracted fractions of lipase.

Fig.2 Correlation between the values of □t and the back-extracted fraction of lipase based on Eq. (1). (○) alkanols and (▲) halogenols

[eqn: {E }_{b} = a( { beta }_{t } { C}_{ Al} ) ~+~ c]	(1)

여기서, [eqn: a]와 [eqn: c]는 비례상수이다. Fig.2는 식 (1)에 기초한 lipase의 Eb 값에 대한 (□tCAl) 값의 상관 관계를 나타내고 있다. 노르말 알코올에 대해서는 Eb 값과 (□tCAl) 값 사이에 선형적인 상관 관계가 있지만, halogenols의 경우에는 이 선형적인 관계에서 벗어남을 알 수 있다. 이러한 결과는, 비록 □t 값이 알코올의 첨가 효과를 설명할 수 있는 평가 인자는 될 수 있지만, halogenol의 효과를 설명하기에는 충분하지 않다는 것을 나타내고 있다.

3.2 AOT-역미셀에서 알코올 분자를 이용한 효소활성의 제어

역미셀계에서의 lipase의 효소반응은 미셀 계면을 통해 계면활성제 분자와 lipase간의 정전기적, 소수성 상호작용에 의해 영향을 받는다. 그러므로 효소와 미셀간의 상호작용은 역미셀에서 효소의 안정성과 활성 수율에 대한 중요한 인자이다. 이 실험에서 사용한 lipase의 최대 활성은 pH 6.3 - 7.3, 함수율 7에서 얻을 수 있었으며, lipase의 상대 활성에 대한 알코올의 첨가 효과는 pH 7.2 과 함수율 7에서 실험하였다. Fig.3은 다양한 알코올의 농도에 대한 lipase의 상대 활성의 의존성을 나타내고 있다. 첨가된 알코올의 농가가 증가함에 따라  lipase의 상대 활성이 선형적으로 감소하고 있다. 본 실험에서는 이 선형적인 기울기 (KRA)를 lipase의 상대 활성에 대한 알코올의 첨가 효과로 정의한다

.

Fig.3 Effect of alcohols on the relative activity of lipase in reverse micelles

Fig.4 The plot of the value of (-KRA) against log P of alcohol molecues.

Fig.4에는 각 알코올의 log P 값에 대하여 (-KRA) 값을 플로트 하였다. Fig.4와 같이 각 알코올의 (-KRA) 값과 소수성 값인 log P값 사이에는 선형적인 상관 관계가 있다. 이 결과는 알코올 분자의 소수성 부분이 lipase의 상대 활성을 감소시키고 있음을 의미한다. 반면에 PrOH의 경우 심각한 오차가 발생했다. 그 이유로는 반응시간 (30분) 동안 PrOH이 비교적 소수성이 낮기 때문에 미셀의 내 수상과 섞여 단백질의 구조 변화를 일으켰다고 생각되며, 좀 더 검토가 필요하다.

4. 결  론

역미셀을 이용한 단백질 역추출시 문제점 중의 하나인 미셀-미셀간 상호작용의 제어를 위해, 보조 계면활성제인 알코올이 lipase의 역추출 거동에 미치는 영향에 대하여 검토하였다. lipase의 역추출율은 첨가한 알코올의 종류와 농도에 크게 영향을 받았지만, 노르말 알코올 첨가의 경우에는 역추출율과 미셀간 상호작용 파라미터 □t를 고려한 (□tCAl) 값 사이에 선형적인 상관 관계가 있었다. 그리고 알코올의 첨가에 의한 lipase 활성 수율의 변화를 올리브 오일을 이용한 가수분해 반응으로 검토하였다. 첨가된 알코올의 농도가 증가함에 따라  lipase의 상대 활성이 선형적으로 감소하였으며, lipase의 상대 활성에 대한 알코올의 첨가 효과로 정의한 (KRA)와 소수성 값인 log P 값과의 상관 관계로부터 알코올 분자의 소수성 부분이 lipase의 상대 활성을 감소시키고 있음을 알았다.

5. 참고문헌

1) Dungan, S. R.; Bausch, T.; Hatton, T. A.; Plucinski, P.; Nitsch, W. J. Colloid Interface Sci. 145, 33, (1991)

2) Dekker, M.; Vant Riet, K.; Bijsterbosch, B. H.; Wolbert, R. B. G.; Hilhorst, R. Chem. Eng. Sci. 45, 2949 (1990)

3) Yamada, Y.; Kasai, K.; Kuboi, R.; Komasawa, I., Kagaku kogaku Ronbunshu, 20, 54 (1994a)

4) Yamada, Y.; Kuboi, R.; Komasawa, I., Solv. Extr. Res. Dev. Japan, 1, 167 (1994b)

5) Hong, D. -P., R. Kuboi and I. Komasawa, Korean J. Chem. Eng., 14(5), 334-340 (1997)

6) Hong, D. -P. and Kuboi, R., Biochem. Eng. J. 4, 23-29 (1999)