구조분석을 위한 미지 생물신소재의 분리·정제법

김찬화

고려대학교 생명공학원

Purification of Unidentified New Biomaterials for Structural Analysis

Chan-Wha Kim

Graduate School of Biotechnology, Korea University

서론

최근 천연물로부터 생리활성이 높은 생물신소재개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 이미 생리활성이 밝혀진 생물소재의 연구도 많이 진행되고 있으나, 우리의 지적재산권을 주장할 수 있는 국내 고유의 생물신소재 연구도 많은 진전을 보이고 있다. 그러나 새로운 생물소재임을 밝히기 위해서는 연구·개발하고 있는 소재의 특성규명이 필수적으로 수행되어야 한다. 이러한 업무를 수행할 국내의 연구기반이 취약하여 대부분 선진국 연구기관이나 위탁실험실(contract laboratory)에 용역을 의뢰하고 있는 실정이다. 이에 따른 국내 산업정보의 유출에 심각한 우려가 제기되고 있다. 이러한 시점에서 최근 산업자원부를 중심으로 한 정부차원의 국내 생물산업 기반구축을 위한 지원계획 수립은 높이 평가되고 있다.

신약개발에서 약효물질의 특성규명은 필수적이며 이를 위해 구조분석(physicochemical characterization)과 생리활성(biological activity) 규명이 수행되어야 한다(US FDA, 1996). 따라서 구조분석은 생물신소재 개발을 위해 필수적으로 수행되어야 할 사항이며, 미지의 생물신소재 구조분석을 위해서는 순도 높은 시료의 준비가 가능하여야 한다. 높은 순도의 구조분석 용 시료를 준비하기 위해서는 이에 부합되는 분리·정제기술이 개발되어야 한다.

본 글에서는 생물신소재의 구조분석 용 시료준비를 위해 활용되는 생물신소재의 분리·정제기술들과 이들은 활용한 사례를 소개하고자 한다.

이론

천연물로부터 생물소재를 분리·정제하는 일반적인 공정흐름은 <그림 1>과 같다.

1. 추출(Extraction)

천연물로부터 생물소재를 분리·정제하는 첫 단계로 생물소재가 수용성일 경우 열수추출이, 지용성일 경우 유기용매추출이 일반적으로 수행된다.

2. 고형물질 제거

추출공정이 완료된 후 고용물질을 추출액으로부터 제거하기 위한 공정으로 원심분리와 여과가 사용되고 있다.

추출

↓

고형물질 제거

↓

침전/농축

↓

정제

↓

농축/건조

그림 1. 생물소재 분리·정제공정.

3. 침전/농축(Precipitation/Concentration)

원심분리나 여과로 고형물질을 제거한 추출액으로부터 생물소재를 분리하기 위해 알코올 침전, salting-out, 결정화(crystallization)공정들이 활용되며, 정제공정의 효율을 높이기 위한 생물소재의 농축공정으로는 증발(evaporation), 흡착/탈착(adsorption/desorption), 한외여과(ultrafiltration)가 있다. 침전공정과 증발을 제외한 농축공정 모두 정제효과를 제공하지만, 아직 잔류불순물이 많아 구조분석을 위해서는 정제공정이 추가로 요구된다.

4. 정제

정제공정은 미지 생물신소재의 구조분석을 위한 시료준비에 가장 중요한 단계로서 잔류불순물의 제거가 주된 목적이 된다. Ion-exchange, gel permeation, reverse phase, affinity 등 크로마토그라피 방법이 주로 사용되며, 한 가지 크로마토그라피의 방법으로는 잔류불순물을 구조분석이 가능한 순도 수준으로 제거할 수 없어 2가지 이상의 방법을 같이 사용하게 된다.

5. 농축/건조

정제과정을 통해 잔류불순물이 제거된 시료는 구조분석을 위한 시료로 제공되기 위해 diafiltration과 같은 농축과정과 동결건조와 같은 건조과정을 거쳐 완성된다.

실험

1. 감귤껍질 플라보노이드

□ 추출

열수추출의 경우, 감귤껍질과 증류수의 비를 1:25(w/v)로 5분 동안 100oC에서 추출하였다. 추출물을 거즈로 입자가 큰 찌꺼기를 거른 후, Whatman No.1 filter와 0.2□ syringe filter를 이용하여 여과한 후 동결건조 하였다.

메탄올추출의 경우, 동결건조된 감귤껍질을 분말로 갈아서 메탄올에서 30분 동안 4회 추출 후, gauze로 여과하였다.

□ 정제

C18 역상칼럼을 사용한 HPLC를 이용하여 플라보노이드를 감귤추출물로부터 정제하였다. 용매는 10mM phosphoric acid가 포함된 20% 메탄올로 2분, 100% 메탄올 gradient로 48분간 용출하였다.

2. 효모세포벽 □-glucan

□ 알칼리 추출

증류수로 3번 세척한 효모세포벽(0.1g/ml)을 2% NaOH를 처리하고 5시간 동안 90oC water bath에서 추출하였다. 알칼리 처리한 세포벽을 원심분리(3,000 g, 10 min)하여 상층액만 회수하고 2M acetic acid로 pH 7로 중화하였다. 중화된 상층액을 상층액:알코올 = 1:3의 비율로 첨가하고 24시간 방치시켜 침전된 □-glucan을 회수하였다.

□ 산처리

□-glucan의 수용성 증가를 위해 3% acetic acid를 처리하고 원심분리(3,000 g, 10 min)하였다.

□ 정제

단백질을 제거하기 위해 DEAE ion-exchange 크로마토그라피를 수행하였다. Running buffer는 10mM phosphate buffer(pH 8.0)이며, 분획된 fraction을 90% 알코올로 침전시켜 24시간 방치하였다. Mannan을 제거하기 위하여 ConA 크로마토그라피를 사용하였다.

□ TNF-□ bioactivity

Raw 264.7을 96 well plate에 5x105cells/well로 부착한 후, 이에 □-glucan을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 상층액을 회수하였다. L292 세포를 96 well plate에 4x104/well로 부착시켜 24시간 동안 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. Actinomycine D(1□/□)와 회수한 Raw 264.7의 배양 상층액을 동시에 L929 세포에 처리하였다. Recombinant murine TNF-□를 standard로 사용하였으며, 37oC, 5% CO2 incubator에서 18시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 0.5% crystal violet으로 염색하였다. 메탄올(100%)로 세포를 lysis 시킨 후 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

□ 생쥐 복강 대식세포의 탐식작용

Mouse macrophage cell line J774A.1(3x105cells/well)을 96 well plate에 부착하고 □-glucan을 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후 FITC-labeled E. coli, 또는 S. aureus를 각 well에 100□(macrophage:bacteria = 1:20)씩 첨가하고, 주어진 기간 동안 배양하였다. PBS로 세척 후 macrophage에 탐식되지 않고 남아있는 FITC-bacteria의 형광을 제거하기 위해 tryphan blue(250□/□, pH 4.4) 100□를 첨가하였다. 1분 후 tryphan blue 제거하고, PBS로 잔류 trypphan blue를 완전히 제거하였다. 0.2% SDS를 함유한 CBS buffer를 각 well에 100□씩 넣어 세포를 용해시킨 후, 485±10nm excitation과 530±12.5nm emission 과정에서 형광강도를 fluoresecence microplate reader로 측정하였다.

결과

1. 플라보노이드

HPLC 분석결과, 열수추출과 유기용매추출 시 2 개의 주요 피크가 확인되었다. 한 피크는 hesperidin으로 확인되었으나 다른 한 피크는 spiking test 결과 문헌에서 보고되는 naringin의 피크가 아닌 것으로 확인되었다. 미국농무성 산하 연구소에 시료를 보내 확인한 결과 narirutin으로 확인되었다.

2. □-glucan

효모세포벽 □-glucan은 □-(1,3)의 main backbone에 □-(1,6)의 side chain을 갖는 glucan이다. 패혈증치료제 개발을 위해 □-glucan의 수용성을 높이려는 연구가 활발하며, 수용성을 증대시키는 한 방법으로 □-(1,6) side chain의 함량을 높이는 노력이 진행되고 있다. □-(1,6) side chain 함량 측정방법으로 NMR이 활용되고 있으며, NMR 분석에 적절한 시료준비가 요구되고 있다.

알칼리추출과 산처리 방법으로 수용성 □-glucan의 회수가 이루어 졌으나, 잔류단백질과 mannan이 과량으로 존재하여 면역기능강화 효과와 구조분석에 어려움이 되었다. DEAE ion-exchange 크로마토그라피로 잔류단백질의 제거가 성공적이었으며, ConA 크로마토그라피로 잔류 mannan의 제거가 가능하였다. 준비된 시료의 bioactivity는 잔류물질의 제거로 증가되었으며 NMR을 이용한 구조분석이 진행되고 있다.

참고문헌

1.	Belter, P. A., E. L. Cussler and W. S. Hu (1988) Bioseparations:	Downstream processing for Biotechnology. John Wiley & Sons, Inc., New	York.

2.	Sharma, B.P. (1994) Cell separation systems. in "Bioprocess Engineering"	(eds Lydersen, B. J., N. A. D'elia and K. L. Nelson), pp 86-117, John	Wiley & Sons, Inc., New York.

3.	US FDA (1996) For the submission of chemistry, manufacturing, and	controls information for a therapeutic recombinant DNA-derived product	or a monoclonal antibody product for in vivo use. Guidance for Industry.