NMR을 이용한 미지 생물신소재의 구조분석

정해갑, 정재준

기초과학지원연구소 자기공명팀

Structural analysis of novel biological materials using NMR spectroscopy

Hae-Kap Cheong, Chaejoon Cheong

Magnetic Resonance Team, Korea Basic Science Institute

1. 서론

NMR의 응용은 매우 광범위하다. 그 이유는 NMR로부터 얻을 수 있는 정보가 매우 다양하기 때문이다. Simple 1D spectrum으로부터 각 원자의 개수와 분자의 functional group 파악이 가능하고, 더 나아가 decoupling 실험과 J 값 측정, NOE 실험 등을 통하여 분자 구조를 분석할 수 있다. 2D 실험을 수행할 경우, 분자의 configuration은 물론 conformation까지 규명할 수 있다. NMR은 분자의 구조에 대한 정보뿐만 아니라 spectrum이나 선폭의 분석을 통한 분자의 운동성과 변온실험을 통한 열역학적 성질에 관한 정보도 제공한다. 여기서는 NMR을 이용하여 천연 추출물, 펩티드, 핵산의 구조를 규명에 관한 내용을 소개한다. 첫번째로 Evodia officinalis (Rutaceae)의 열매로부터 추출한 항암물질의 구조 확인하는 방법을 소개한다. 두번째로 Asian toad, Bufo bufo gargarizans,의 위세포에서 발견된 항미생물 펩티드인 buforin II의 3차원 구조연구를 소개한다. 세 번째로 yeast Saccharomyces cerevisiae virus의 packaging에 관여하는 stem-loop RNA의 3차원 구조를 규명한 결과를 소개한다.

2. 천연물의 구조분석

천연 추출물의 경우 분자량은 대개 1,000 미만이다. 어떤 물질을 추출하였을 경우 분자량 축정과 원소분석이 NMR 실험에 앞서 선행되어야 한다. 최근 고분해능 질량분석기로는 동위원소 비율을 계산함으로써 분자내 원소구성비까지 구할 수 있다. Carbon과 proton의 chemical shift를 참조하여 분자의 functional group을 알 수 있다. 그리고 spectrum의 peak를 integration하여 분자내 수소와 탄소의 수를 계산한다. DEPT 실험을 통하여서는 각 탄소의 수소결합 차수를 결정한다. 분자량과 탄소 및 수소의 수로부터 다른 원소의 수를 결정한다. 대부분의 유기화합물은 산소나 질소 원자가 존재하는 경우가 많은데, 이 경우 solvent에 따라 산소나 질소에 결합된 exchangeable proton이 NMR spectrum에 나타나지 않는 경우가 많으므로 주의해야 한다. NMR과 질량분석, 그리고 원소분석 data로부터 분자식을 일단 결정한다. 그리고 chemical shift와 DEPT 실험등을 통하여 대략적인 구조식을 파악한다. 분자 구조에 관한 정보를 얻기 위하여서는 각 NMR peak가 어느 원자핵으로부터 나오는가를 결정하여야 한다. 이를 위하여 chemical shift, peak splitting pattern 및 integration 값, DEPT와 2D HMQC spectrum, decoupling 실험 data, 2D COSY spectrum 등을 활용하여야 한다. Carbon peak assignment를 위하여서는 2D HMQC와 HMBC 실험을 실행한다. 경우에 따라서는 2D NOESY나 1D NOE 실험이 필요할 때도 있다. 분자구조 분석은 주로 dihedral angle과 proton 간의 거리를 결정함으로써 이루어진다. Vicinal J 값으로부터는 dihedral angle에 관한 정보를 얻을 수 있으므로 relative configuration과 conformation을 결정할 수 있다. Proton 간의 거리가 0.5 nm 이하일 경우 dipolar interaction에 의한 NOE를 관측할 수 있다. 분자량이 1,000 미만일 경우에는 대부분 positive NOE를 나타내는데 분자량이 1,000~2,000 사이에서는 NOE가 나타나지 않는 경우도 있다. 이때는 2D ROESY 실험을 하면 NOE를 관측할 수 있다.

Evodia officinalis (Rutaceae)의 열매는 한방에서 gastrointestinal disorders, postpartum hemorrhage, amenorrhea의 치료제로 쓰여왔다. 이 식물에서 추출된 alkaloids와 terpenes의 천연물들은 이미 보고된 바 있다. 이 식물의 열매 추출물 분리과정에서 항암성분의 새로운 quinoline derivative (A) 물질 (2-hydroxy-4-methoxy-3-(3'-methyl-2'-butenyl)-quinoline)과 5개의 알려진 alkaloids를 발견하였다.

A

천연물 A는 FAB-mass spectrum에서 m/z 244.0 (calculated for C15H17NO2, 243.1259)의 M+1 peak를 보여주었고, 이 화합물의 분자식은 고분해능 FAB-mass spectrum으로부터 확인하였다. Carbon nmr과 DEPT 실험에서 A는 15개의 carbon peak를 보여주고, 3개의 methyl, 1개의 methylene, 5개의 methine, 6개의 quarternary carbon이 있다는 것을 확인하였다. Quarternary carbon중 2개는 산소가 결합되어 있기 때문에 downfield shift (162.0 와 166.1 ppm)된 peak를 보여주었고, proton nmr에서도 methoxy group과 hydroxy group을 확인할 수 있었다. 1H-1H COSY 실험으로 aromatic ring의 proton (5, 6, 7, 8)들의 연결성을 확인할 수 있었다. HMQC spectrum으로부터 direct 1J carbon-proton connectivities를 모두 확인할 수 있고, HMBC spectrum으로부터 이웃한 carbon과 proton (3J와 4J)을 확인할 수 있었다. 4번 carbon의 경우 1□, 5, 그리고 methoxy proton으로의 HMBC cross-peak를 확인하여 그 위치를 정할 수 있었다. 이러한 결과들을 종합하여 천연물 A가 2-hydroxy-4-methoxy-3-(3'-methyl-2'-butenyl)-quinoline의 구조를 가진다는 것을 규명하였다. 천연물 A는 human lung carcinoma cells에 대해 IC50 9.9 ug/ml, human colon carcinoma cells에 대해 IC50 12.0 ug/ml의 항암효과가 나타나는 것을 볼 수 있었다.

3. 항미생물 펩티드의 구조분석

현대 solution NMR 기법은 단백질이나 핵산등 생체고분자의 3차원적 입체 구조를 atomic resolution으로 규명하는 것을 가능하게 한다. 생체고분자의 경우, primary structure인 아미노산 서열이나 염기 서열은 다른 방법으로 결정하고 NMR을 통하여 구조분석을 시작한다. 우선 다양한 2D (분자량이 클 경우에는 3D, 4D) 실험을 통하여 proton resonance를 assign한다. Assign을 많이 할수록 구조를 더 정확하게 구할수 있다. 3차원적 입체구조를 규명하기 위해서는 NOESY data가 필수적이다. Mixing time이 다른 여러개의 2D NOESY spectra를 동일한 조건에서 얻고 crosspeak volume을 integration하여 proton 간 거리에 관한 정보를 얻는다. Phase-sensitive COSY나 DQF-COSY, heteronuclear COSY로부터 J 값을 측정하여 dihedral angle에 관한 정보도 얻는다. 이러한 proton 간 거리와 dihedral angle에 관한 정보를 이용하여 분자구조를 modeling한다. Modeling에는 distance geometry, energy minimization, molecular dyanmics 등의 방법이 사용된다.

Asian toad, bufo bofo gargarizans의 위조직에서 항미생물 펩티드인 buforin I이 발견되었다. 이 펩티드는 fungi를 포함해서 다양한 종류의 미생물에 대해 강한 항미생물 활성을 보여주었다. Buforin II는 buforin I에서 유도된 21개의 아미노산을 가지는 cationic 펩티드로서  buforin I에 비해 2배정도의 항미생물 활성을 가진다. 이와 비슷한 cationic 항미생물 펩티드인 magainin 2가 Xenopus laevis의 피부에서 발견되었다는 보고가 있었다. 이 magainin 2는 trifluoroethanol(TFE)/H2O에서 alpha-helix를 이루고, charged residue들이 한쪽방향에 있고, hydrophobic residue들이 반대방향에 있는 amphipathic 성향을 보이고 있다. 본 연구에서는 primary sequence가 magainin 2에 비해 매우다르고 항매생물 활성이 20배 정도 높은 펩티드인 buforin II의 구조를 NMR을 이용하여 규명하였다.

Sequential assignment와 structure determination을 위해서 DQF-COSY와 TOCSY, NOESY 실험을 수행하였다. 구조계산은 distance geometry 방법과 restrained molecular dynamics를 이용한 simulated annealing 방법을 병행하였다. H2O에서는 전형적인 sequential amide-amide crosspeak를 관찰 할 수 없고, random coil의 형태의 구조를 가진다고 할 수 있다. 하지만 TFE/H2O 용매내에서 NH(i)/NH(i+1)의 sequential NOE들을 관찰 함으로서 helical conformation의 존재를 확인하였다. Sequential connectivity들과 long-range interaction을 통해서 buforin II는 Gly7에서부터 Arg20까지 alpha-helix 구조를 가진다는 것을 확인하였다. 전체적인 구조는 Gly7에서부터 Arg20까지 helical 구조를 가지지만 Pro11 부근에서 distortion이 있다. 이 부위에서는 sequential NOE들이 약하고, chemical shift들이 전형적인 alpha-helix의 것으로부터 upfiled shift되어 있는 것을 관찰하였다. 이러한 NMR data 결과로부터 buforin II는 Gly7에서부터 Arg20까지 helical 구조를 가지지만 Val12에서 Arg20 까지는 정상적인 alpha-helix이고, Phe10부터 Val12 까지는 distortion 되어 있으면, Gly7에서 Phe10까지는 C-terminal alpha-helix에 비해 flexible한 구조를 가진다는 것을 알 수 있었다. NMR data를 이용하여 distance geometry와 restrained molecular dynamics를 이용하여 계산된 3차원 구조를 그림 1에 나타내었다.

그림 1 Buforin II의 3차원 구조.

4. 바이러스 RNA의 구조분석

Saccharomyces cerevisia virus (ScV)의 cap-pol fusion protein은 virus의 plus strand RNA의 packaging에 관여하는 stem-loop 구조를 선택적으로 recognize해서 genomic RNA를 mature virion으로 되는 virus particle을 만들게 된다. 이 viral particle binding sites (VBSs)는 stem-loop 구조를 가지며, virus의 생활사에서 중요한 역할을 하게 된다. ScVM1에는 2개의 VBS가 존재하는데, 그중 하나인 SL1은 20개의 nucleotide로 구성되어 있고, 1개의 A bulge와 5 nucleotides loop와 2개의 stem으로 되어있다. 다른 하나인 SL2는 SL1과 같은 loop를 가지고 있으나, bulge대신에 더 큰 internal loop를 가지고 있고, 2개의 stem을 가지고 있다. 본 연구에서는 이 두 VBS의 구조를 NMR과 molecular modeling을 이용하여 규명하였다.

DQF-COSY와 TOCSY, NOESY 실험을 통해서 sequential assignment를 하였다. Carbon, nitrogen, phosphorous를 이용한 HMQC, HSQC, HMQC-NOESY, HetCOR, HetTOCSY 실험을 수행하여 assignment를 확인하고 dihedral angle 정보를 구하였다. Peak assignment를 하고 crosspeak integration을 통해서 얻은 constraints를 이용하여 molecular dynamics를 통해 SL1과 SL2 RNA의 3차원 구조를 규명하였다.

그림 2 (위) SL1의 3차원 구조 (아래) SL2의 3차원 구조

SL1과 SL2는 동일한 loop sequence를 가지고 있고, 비슷한 3차원 구조를 가진다는 것을 밝혀냈다. 전체적으로는 A-form helix를 가지고 있지만 bulge 부위에서 distortion이 생김을 알 수 있다. Loop 부위의 3rd U와 4th U는 비정상적인 C2'-endo 구조를 가지며 1st G와 5th C는 hydrogen bond를 하고 있다. SL1의 bulged A는 stack in 되어 있다. SL2의 internal loop는 highly dynamic character를 보여주고 있고, 하나의 U가 bulge out 되고 internal loop에서 helical bending이 일어나는 것을 알 수 있다. NMR data로부터 molecular modeling을 한 SL1과 SL2의 3차원 구조를 그림 2에 각각 나타내었다.

5. 참고문헌

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