당에스테르의 효소적 합성

이현규, 조정연, 유인상, 이성철*, 윤현희

경원대학교 화학공학과

Enzymatic Synthesis of Sugar Fatty Acid Esters

Hyun Kyu Lee, Joung Yean Cho, In Sang Yoo, Seong Cheol Lee*,

and Hyon Hee Yoon

Department of Chemical Engineering, Kyungwon University

Dansuk Industry Co., Ltd.*

서 론

기능성 당에스테르(sugar fatty acid esters)는 비이온성, 생분해성, 그리고 무독성 계면활성제로서 식품유화제, 화장품유화제, 과일도포제 및 건강지향성 지질 대체 식품으로 사용된다. 이와 같은 당에스테르는 고부가가치의 식품 관련 신소재로서 천연유기지방산(lauric, myristic, palmitic, stearic, oelic acid 등)과 각종 당성분(sugars 또는 sugar alcohols)과의 transesterification 반응을 통해 생성된다.[1] 당에스테르는 공업적으로 당과 지방산을 원료로 사용하여 화학적합성방법으로 생산되고 있으나, 최근에는 환경친화성이 우수한 효소적인 합성법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다[2]. 화학적 합성법에 의한 당에스테르의 생산은 과도한 용매 및 화학물질 사용과 에너지 소모가 많다는 문제점을 갖고 있다. 반면에 생체촉매기술의 발전과 함께 경제성이 향상되고 있는 효소적 합성법은 소량의 유해 화학물질을 사용하고 에너지사용이 최소화되는 장점을 갖고 있다.[3]

본 연구에서는 지방산과 당으로부터 당에스테르를 효소적으로 합성하는 반응의 특성을 조사하기 위하여, 지방산과 당의 종류, 유기용매의 종류, 효소사용량 등을 변화시켜 당에스테르의 합성실험을 수행하였다. 본 실험에 사용한 당은 methyl-glucoside와 glucose, 지방산은 stearic acid, palmitic acid, oleic acid)을 사용하였고, 반응매질인 유기용매는 acetone과 2-methyl-2-propanol (tert-butyl alcohol)을 사용하였다. 지방산과 당의 acylation 반응을 위한 효소는 lipase(Novozym 435)를 사용하였다.

실험재료 및 방법

Acetone(또는tert-butyl alcohol) 30ml에 1.164g의 methyl-glucoside (6mmol) 또는 glucose 1.08g (6mmol)과 0.568g의 stearic acid (2mmol), 0.512g의 palmitic acid (2mmol), 0.63ml의 oleic acid (2mmol)를 각각 50ml vial에서 용해시키고 수분제거를 위해 250℃에서 하루동안 건조시킨 molecular sieve를 충분히 넣어준 후 반응온도 55℃로 유지된 air bath에서 5분간 교반한 후에 0.3g의 Novozym 435 (immobilized lipase from Candida antarctica onto macroporous acrylic resin, EC 3.1.1.3, 활성도 7000 PLU (propyl laurate units)/g, 수분함량 1∼2 % (w/w), 입경 0.3∼0.9mm, 벌크밀도 430 kg/m3, Novo Nordisk)를 첨가하여 sugar와 fatty acid의 아실화 반응을 수행하였다. 매시간마다 시료를 채취하여 원심분리 후 상층의 맑은 액만 취하여 HPLC로 fatty acid의 농도를 분석하였다. 당에스테르의 수율은 지방산의 소모량으로부터 계산하였다.

효소사용량이 영향을 조사하기 위한 실험에서는 2-methyl-2-propanol (tert-butyl alcohol)을 반응매질로 하여 30ml에 1.164g의 methyl-glucoside (6mmol)와 0.512g의 palmitic acid (2mmol)를 용해시키고 Novozym 435를 각각 반응체적의 0.1%, 0.5%, 3%(w/V)로 첨가하여 아실화 반응을 수행하였다.

지방산, 당, 당에스테르의 농도는 HPLC를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석조건은 다음과 같다.

Column :  □-Bondapak C18 column(3.9 ×300 mm, Waters)

Mobile phase : Methanol : Acetonirtile : H2O = 5 : 4 : 1

Flow rate : 0.5 ml/min

Sample injection volume : 10 □

실험결과 및 토론

Figure 1과 2는 당원으로 methyl-glucoside를 사용한 실험 결과이다. 반응매질로 acetone을 사용한 경우 지방산의 종류에 따라 전환율이 크게 변하지 않았으며, 반응시간 40시간후 약 80%의 전환율을 나타내었다(Figure 1). 그러나 반응매질로 효소반응이 tert-butyl alcohol 을 사용한 경우에는 지방산의 종류에 따라 전환율이 현저한 차이를 나타내었다. 즉, oleic acid는 80%까지 전환되었으나, palmitic acid의 전환율은 60%이었다(Figure 2). 또한 Figure 1과 2를 비교하여보면, 반응매질이 반응 속도에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있다. Figure 1과 2에서, 합성반응 초기(3시간까지)의 전환율을 비교해 보면 효소반응이 tert-butyl alcohol (oleic acid  48.6%)에서 acetone (oleic acid  23.7%)에서보다 약 2배가량 빠른 전환율을 보이는데 이것은 두 유기용매에 대한 methyl-glucoside의 용해도 차이 때문이라고 판단된다.

Figure 3과 4는 당원으로 glucose를 사용한 실험 결과이다. Methyl-glucoside의 경우와 유사한 반응특성을 보여주고 있으나, methyl-glucoside에 비하여 전반적으로 전환율이 10-20%까지 낮은 것으로 나타났다. 이러한 현상은 glucose가 methyl-glucoside에 비하여 유기용매에 대한 용해도가 작기 때문이다. 따라서 이상과 같은 실험결과로부터 반응속도 및 전환율을 향상시키기 위해서는 당원의 용해도를 높이는 방향으로 효소반응조건을 찾아야 할 것이다.

Figure 5는 당에스테르반응에서 효소사용량의 영향을 조사한 것이다. 효소사용량의 증가에 따라 전환율 및 반응속도가 향상되는 것으로 나타났으며 효소사용량이 반응용액의 0.5%(기질 기준 약 10%)이상에서는 효소사용량의 증가가 불필요한 것으로 나타났다.

참고문헌

1. Akoh, C. C. and Swanson, B. G. (1994), Carbohydrate Poyesters as Fat

Substitutes, Marcel Dekker, Inc., New York.

2. Sarney, D. B. and Vulfson, E. V.(1995), Application of enzymes to the

synthesis of surfactants, Trends in Biotechnology, 13, 164-172.

3. Akoh, C. C. (1995), Liplid-Based Fat Substitutes, Critical Reviews in Food

and Nutrition, 35(5), 405-430.

Figure 1. Esterification of stearic, palmitic, and oleic acid with

methyl-glucoside by lipase-catalyzed in acetone.

Figure 2. Esterification of stearic, palmitic, and oleic acid with

methyl-glucoside by lipase-catalyzed in tert-butyl alcohol.

Fig..3. Esterification of stearic,           Fig. 4. Esterification of stearic,

palmitic, and oleic acid with glucose     palmitic, and oleic acid with glucose

by lipase-catalyzed in acetone.          by lipase-catalyzed in tert-butyl

alcohol.

Figure 5. Effect of enzyme contents on conversion of palmitic acid in

lipase-catalyzed mono-acylation of methyl glucoside and palmitic acid .