Wettable powder와 Oil/Water 에멀젼을 이용한 미생물 살충제의 제제화

김주현, 오경근*, 윤철식**, 김승욱, 홍석인

고려대학교 화학공학과, 단국대학교 공업화학과*,

고려대학교 공학기술연구소**

Formulation of microbialpesticide with oil/water emulsion and wettable powder

Juhyun Kim, Kyeong-Keun Oh*, Cheol-Sik Yoon**, Seung-Wook Kim, Suk-In Hong

Department of Chemical Engineering, Korea University, Seoul 136-701, Department         of Industrial Chemistry, Dankook university, Cheonan, 330-714*, Research Institute of Engineering and Technology, Korea University, Seoul 136-701**

1. 서론

기존의 화학 살충제는 강한 살충력으로 농업 생산량을 증대시키는데 큰 공헌을 하였으나 토양을 변성시키고 물이 오염되는 등 환경에는 좋지 않은 영향을 미쳐 왔다. 또한 해충에 살충제에 대한 내성이 생기면서 점차 많은 양의 살충제를 투여해야 하게 되었으며 이에 따라 환경은 더욱 오염되는 악순환이 되풀이되었다. 이에 효과적인 살충율을 유지하면서도 환경에 미치는 부작용이 없는 균주를 개발하였고 본 연구는 그 균주를 실제 사용에 적합하도록 제제화 하는 것이다.

균주는 배추 좀나방에 대해 살충력을 가진다고 확인된 Beaveria bassiana를 사용하였고, 이 균주의 제제화를 위해 wettable powder formulation과 oil/water emulsion을 도입하였다.

효율적인 oil/water emulsion을 이용한 제제화를 위하여 적합한 물질을 탐색하고 계면 활성제와 식물성 유지, 염의 적절한 배합을 통해 안정하고 균일하며 효과적으로 포자를 제제화 할 수 있도록 하였다. 이를 제타포텐셜과 식물성 유지 방울의 크기 분포를 종속 변수로 하여 표면 분석법으로 최적화 하였다.

2. 실험 방법

wettable powder formulation을 위한 물질 탐색

wettable powder formulation을 위한 물질 탐색은 균주에 무해한 물질들을 먼저 선별한 후에 각각의 자외선 차단 능력을 검증하여 이루어졌다. 균주에 무해한 물질의 선별은 1.0×107의 균농도와 자외선 차단제를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0%(v/v)로 균 현탁액을 만들고 PDA배지를 슬라이드 글라스에 1□에 도말한다. 균 현탁액을 각각 PDA배지를 입힌 슬라이드 글라스에 한 방울씩 뿌려서 12 시간 후에 발아율을 현미경으로 관측한다.

자외선 실험으로는 자외선 램프를 단 상자를 만든다. 발아율 실험에서 균주에 무해하다고 밝혀진 물질들에 대해서 1.0×105의 균농도로 그리고 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0%(v/v)의 자외선 차단제의 농도로 균 현탁액을 만들고 자외선 상자 안에서 0.5, 1.0, 1.5, 2.0시간이 지난 후 볼텍스에 돌려서 균을 떨구어 내고 PDA배지에 뿌린 후 삼각 로드로 펴 주었다. 진탕배양기에서 3일간 배양한 후 CFU(Colony Forming Unit)를 세었다.

Oil/water emulsion을 이용한 제제화를 위한 물질 탐색

wettable powder formulation에서와 마찬가지로 균주에 무해한 물질들을 먼저 선별한 후에 각각의 자외선 차단 능력을 검증하여 이루어졌다. 먼저 7가지의 식물성 유지를 각각 2%씩 그리고 계면활성제인 tween-80을 2%씩 넣고 2000 rpm에서 5분간 돌려서 oil/water emulsion을 만들고 여기에 2% agar,를 넣고 슬라이드 글라스에 1□씩 도말하였다. 1.0×107농도로 균 현탁액을 만들고 각각 한 방울씩 PDA위에 도말하고 25℃ 진탕배양기에서 12 시간 후 발아율을 현미경으로 관측하였다.

자외선 실험을 7가지 식물성 유지에 대하여 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0%(v/v)로 하고 균농도는 1.0×105로 하여  앞에서와 같이 실험하였다.

Oil/water emulsion에서 oil, 계면활성제, 염의 농도 범위의 제한

2% tween-80에 대해 식물성 유지를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10%(v/v)씩 농도를 달리하여 emulsion을 만들고 층이 분리되어 크림이 형성되는 시간을 관측하였다.

2% 식물성 유지에 대해 계면활성제를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10%(v/v)씩 농도를 달리하여 emulsion을 만들로 층이 분리되어 크림이 형성되는 시간을 관측하였다.

2% 식물성 유지와 2% 계면활성제에 대해 Tween-80과 span-80으로 HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance)를 달리하여 제타포텐셜을 측정한다. 제타포텐셜이 가장 큰 HLB No.에 대해 염으로 염화 나트륨을 각각10-2,10-3,10-4, 10-5, 10-6, 10-7 0 mol/□의 농도로 달리하여 emulsion을 만들로 제타포텐셜을 측정하였다.

Oil, 계면활성제, 염 농도의 최적화.

표면분석법으로 oil의 농도 계면활성제의 농도 염의 농도를 달리하여 제타포텐셜과 크기 분포의 종속 변수를 측정하여 각각의 농도를 최적화 하였다.

3. 결과 및 토의

wettable powder formulation을 위한 물질 탐색

발아율 실험 결과 marasperse N-22, fluorescein disodium, dialite, montmorillonite, pyridoxine hydrochloride, corn starch가 포자 발아를 억제하지 않는 것으로 나타났고 자외선 상자에서 실험한 결과 dialite, montmorillonite가 자외선을 충분히 잘 차단하는 것으로 나타났다.

표 1. Montmorollonite의 자외선 차단 실험  (단위 : CFU)

Oil/water emulsion을 이용한 제제화를 위한 물질 탐색

발아율 실험 결과 7가지 식물성 유지 중에서 linseed oil, cottonseed oil, soybean oil이 emulsion상에서 포자가 발아를 비교적 빨리 하는 것으로 사료되었고, 자외선 실험 결과 cottonseed oil, soybean oil, olive oil이 자외선 차단 효과가 좋은 것으로 나타났다. 따라서 cottonseed oil과 soybean oil을 oil/water emulsion실험에 사용하였다.

Oil/water emulsion에서 oil, 계면활성제, 염의 농도 범위의 제한

크림이 형성되는 시간을 측정한 결과 식물성 유지와 계면활성제는 각각 2%로 하였을 때 12 시간 정도로 emulsion이 안정하게 되고 HLB No.는 cottonseed oil의 경우 9, soybean oil의 경우 10정도에서 제타포텐셜이 음으로 절대값이 크게 나타났다. 또한 염화 나트륨의 농도를 변화시키면서 제타포텐셜을 측정하였을 때는 10-5mol/□에서 제타포텐셜이 급격하게 감소하는 것으로 관측되었다.

Oil, 계면활성제, 염 농도의 최적화.

Cottonseed oil과 soybean oil을 각각 oil 2% 계면활성제 2% HLB No.를 cottonseed oil에 대해서는 9 soybean oil에 대해서는 10, 염화나트륨은 10-5mol/□를 중심으로 잡고 그 주변의 제타포텐셜과 oil방울 크기 분포를 측정하여 최적 농도를 산출하였다. 그 결과 cottonseed oil은 oil 1.5%, 계면활성제 2%, 염화나트륨5.0×10-6mol/□에서 soybean oil은 oil 1.5%, 계면활성제 2%, 염화나트륨 1.0×10-7mol/□에서 가장 안정한 것으로 나타났다.

그림 2. cottonseed oil의 계면활성제와 오일에

따른 제타포텐셜

그림 1. 식물성 유지의 발아율 실험

4. 참고문헌

1. D. Fennell Evans, and Haken Wennerstarom, "The Colloidal Domain    Where Physics, Chemistry, Biology, and Technology Meet," VCH        publishers, Inc., 451-496, 1994

2. J. Fargues, M.S. Goettel, and N. Smits, Mycopathologia, 135, 171,       1996

3. D. Moore, P.D. Bridge, and P.M. Higgins, Ann. appl. Biol., 122, 605,     1993

4. G. Douglas Inglis, Dan L. Johnson, and M.S. Goettel, Eviron.           Entomol., 26(12), 400, 1997

5. Muhannad Jumaa, and Bernd W. Muller, International Journal of        Pharmaceutics, 183, 175, 1999