고정화 Phanerochaete chrysosporium을 이용한 다환 방향족 화합물의 분해

서 윤 수, 류 원 률1, 김 창 준, 장 용 근, 조 무 환1

한국과학기술원 생물공정연구센터 및 화학공학과, 1영남대학교 공과대학 응용화학부

Biodegradation of PAHs (polycyclic aromactic hydrocarbon) using immobilized cells of Phanerochaete chrysosporium

Yoon Soo Seo, Chang Joon Kim, Yong Keun Chang, and Moo Hwan Cho1

Bioprocess Engineering Research Center and Department of Chemical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Taejon 305-701, Korea, 1School of Chemical Engineering & Technology, Yeungnam University, Kyongsan 712-749, Korea

서 론

PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons)는 2개 이상의 벤젠 고리로 이루어진 화합물로 자연계에 널리 분포하며, 돌연변이 및 암을 유발할 수 있는 물질로 알려져 있다. PAHs는 탄소와 수소가 주성분으로 유기물의 연소가 매개되는 과정이면 언제든지 발생할 수 있다. 대개 석탄 건류 공정, 화력 발전, 제철 공정, 타이어 및 아스팔트 생산 공정, 석유 정제 공정, 쓰레기 소각 공정 등에서 PAHs가 발생하며 목재 건조제나 의료용 방부제로 이용되는 creosote, anthracene-oil, coal-tar의 경우에도 PAHs 함량이 높다. PAHs는 구조가 매우 안정하여 분해가 힘들뿐만 아니라 물에 대한 용해도가 낮으며 소수성을 띠고 있기 때문에 토양의 유기 성분에 강하게 흡착되어 심각한 토양 오염을 유발하기도 한다.

PAHs를 제거하기 위한 물리·화학적인 공정은 대부분이 용매를 이용하여 토양층의 PAHs를 제거하는 것으로, 분해가 아닌 단순한 제거라는 근본적인 한계가 있다. 따라서, 백색부후균 (white-rot fungi) 등의 미생물에 의한 PAHs의 분해에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 리그닌 분해에 관여하는 효소는 LiPs (lignin peroxidases), MnPs (manganese peroxidases), laccases 등이며 그 기작이 비기질적 특이성을 갖고 있어서 벤젠 고리를 가진 다양한 물질들을 기질로 이용할 수 있다. 이들 효소의 분비는 2차 대사에 의한 것으로 질소원의 고갈시 이루어진다. 백색부후균은 filamentous fungi로 균사체를 형성하면서 생장하기 때문에 여러 가지 불리한 배양조건을 가지며 PAHs의 분해가 매우 느린 단점도 있다. 그러나, 고정화 세포 시스템을 이용하게 되면 이런 불리한 배양 조건을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 높은 세포 농도와 분해 활성을 유지할 수 있기 때문에 경제적인 공정을 실현할 수 있을 것으로 기대된다.

실 험

사용한 균주는 Phanerochaete chrysosporium(ATCC 24725)이었으며, glycerol stock 형태로 보관하였다. 실험에 이용한 배지는 3가지 종류로, 포자형성배지, PAH 분해배지, 성장배지이었다. 포자형성배지는 본 연구실에서 개발한 배지로 조성은 다음과 같다. Glucose, 80 g/L ; yeast extract, 30 g/L ; urea, 2 g/L ; NaNO3, 3 g/L ; KH2PO4, 2 g/L ; KCl, 0.5 g/L ; MgSO4, 0.5 g/L ; FeSO4 (5 g/L), 1 mL/L. PAH 분해배지로는 질소원이 제한된 Tien and Kirk's medium을 사용하였다. 한편 반복회분식 실험을 위해 우선 고농도의 고정화세포를 얻어야 하는데 이를 위하여 사용한 성장배지의 조성은 다음과 같다. Glucose, 60 g/L ; yeast extract, 30 g/L ; potato dextrose, 30 g/L.

분해대상 PAH는 pyrene, anthracene으로 각각을 개별적으로 또는 혼합하여 첨가한 3가지 조건에서 반복회분식 실험을 실시하였는데 각각의  PAH의 농도는 30 mg/L이었다. PAH 농도가 5 mg/L 미만일 때 배지를 교체해 주는 식으로 반복회분식 조업을 하였다. 한편 반복회분식 조업의 결과와 비교하기 위해 현탁회분식 조업을 상기한 바와 마찬가지로 3가지 조건하에서 실시하였다.

균체의 농도는 건조 세포 중량으로 측정하였다. 고정화세포 배양의 경우 세포가 고정화된 세포형태와 고정화되지 않은 유리세포(free-released cell)의 2가지 형태로 존재하므로, 전체세포농도 뿐만 아니라 실제 담체에 고정화된 세포부하량(cell loading)도 구하였다. Glucose의 농도는 glucose enzyme kit(영동제약)을 이용하여 측정하였다. NH4+의 농도는 ion chromatography, PAHs의 농도는 HPLC를 이용하여 측정하였다.

결과 및 토론

반복회분식 조업에 의한 pyrene의 분해

Pyrene을 분해하는 반복회분식 조업을 12회분 수행하였다. Fig. 1.에 반복회분식 조업시 pyrene 농도의 변화를 나타내었다. 첫 번째 회분에서는 30 mg/L의 pyrene을 분해하는데 6일이 소요되었으며 네 번째 회분에서는 분해속도가 증가하여 4일만에 분해되었다. 한편, 여섯 번째 회분부터는 분해속도가 급격히 감소하여 8일만에 분해가 이루어졌다. 분해속도는 증가하다가 감소하는 형태를 나타내었으며 최대분해속도는 6.58 mg/L·day로 뒤에 보여줄 현탁회분식 조업의 결과인 2.31 mg/L·day에 비하여 3배정도 향상된 값이었다. Fig. 2.는 각 회분에 따른 세포농도의 변화를 나타내었다. 세포농도는 회분수가 증가함에 따라 급격히 감소하였고, specific degradation rate는 꾸준히 증가하다가 다섯 번째 회분 이후부터 두드러진 감소를 보였다. 이는 거듭된 질소원 결핍 배지에서의 배양을 통해 계속 분해에 적합한 조건이 주어져 세포의 분해능이 증가하였으나, 장기간의 질소원 결핍으로 인해 결국에는 세포의 전체 대사가 감소하였으며 이에 따라 세포의 PAH 분해능이 감소한 것으로 판단된다. 이러한 결론을 바탕으로 세포의 전체적인 활성을 증가시키고자 일곱 번째 회분 이후 다시 성장배지에서 5일간 배양하였다. 그 결과 분해속도, specific degradation rate는 다시 향상되었으며, 앞의 결과와 마찬가지로 증가하다가 감소하는 거동을 보였다. 그러나 분해속도의 경우 이전의 최대값에는 이르지 못하였다. 이는 세포활성의 재생이 부분적으로 가능한 것을 의미한다. Table에 현탁조업시와 반복회분식 조업시의 PAHs의 분해속도를 비교하였다.

반복회분식 조업을 통한 anthracene의 분해

대상 PAH를 anthracene으로 바꾸어 앞의 실험과 동일한 조건하에서 10회에 걸친 회분실험을 수행하였다. Pyrene의 경우와 마찬가지로 회분수가 증가함에 따라 분해속도가 증가, 감소하는 현상을 보였다. 세포농도는 pyrene의 경우와 마찬가지로 급격히 감소하였으며 specific degradation rate는 꾸준히 증가하는 형태를 보였다.

반복회분식 조업을 통한 pyrene, anthracene 혼합물의 분해

Pyrene과 anthracene을 각각 30 mg/L씩 넣어 준 것 외에는 다른 조건들은 앞의 경우와 같았으며 실험은 7회분간 수행하였다. 분해속도 및 세포농도의 변화 등의 거동은 이전의 pyrene, anthracene 각각을 분해하는 경우와 비슷하였다. 분해속도는 다소 증가하다가 감소하는 양상을 나타내었으며 네 번째 회분에서 최대값을 보였다. 이때 분해속도는 anthacene의 경우 4.49 mg/L·day, pyrene의 경우 4.26 mg/L·day이었다. PAH를 개별적으로 첨가한 경우와 비교할 때 분해속도가 낮았는데, 이는 총 PAH의 농도가 2배로 증가하였으므로 이것이 세포에 독성 또는 저해효과를 미친 결과라고 생각된다. 본 연구의 결과는 또 다른 관점에서도 상당한 의미가 있을 것으로 생각되는 바, 일반적으로 PAH의 농도가 50 mg/L 이상이 되면 세포에 치명적이라고 알려져 있는데, 본 실험의 경우 농도가 60 mg/L이었음에도 불구하고 분해활성이 크게 저하되지 않았다. 이는 고정화세포의 경우 세포에 치명적인 물질의 영향이 물질전달상의 제약에 의해 완화되었기 때문이라고 생각할 수 있으며, 이는 고정화를 통해 독성물질에 의한 충격부하로부터 세포가 보호될 수 있음을 의미한다.

Table  Degradation rates of PAHs

	Suspended-batch operation		Immobilized repeated-batch operation
	anthracene degradation rate (mg/L·day)	pyrene degradation rate (mg/L·day)	anthracene degradation rate (mg/L·day)	pyrene degradation rate (mg/L·day)
Anthracene degradation	2.15	-	5.36	-
Pyrene degradation	-	2.31	-	6.58
PAHs mixture	1.75	1.64	4.49	4.26

감 사

본 연구는 1999년도 교육부 생물화학공학 학술연구조성비 지원사업(과제번호: 생물화학공학, 1998-020-E3106)에 의한  연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다

.

Figure 1. Degradation of pyrene in repeated-batch operations using immobilized cells

Figure 2. Cell concentrations and cell loadings in repeated-batch degradation of pyrene using immobilized cells

참고 문헌

1. Cerniglia, C. E. (1993), Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons, Current Opinion in Biotechnology, 4, 331-338

2. Field, J. A., E. D. Jong, G. F. Costa and J. A. M. de Bont (1992), Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by new isolates of white rot fungi, Appl. Environ. Microbiol., 58, 2219-2216

3. Reddy, C. A. (1995), The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants, Curr. Opin. Biotechnol., 6, 302-328

4. Dan, L., M. Alic and M. H. Gold (1994), Nitrogen regulation of lignin peroxidase gene transcription, Appl. Environ. Microbiol., 60, 3447-3449

5. Lee, T. H. (1997), Development of two stage continous fermentation process for cyclosporium A production by using immobilized fungal cell, Tolypocladium inflatum, Ph. D. Dissertation, KAIST

6 Tien, M. and T. K. Kirk (1988), Lignin peroxidase of Phanrochaete chrysosporium, Meth. Enzymol., 161, 238-249

7. Gbewonyo, K. and D. I. C. Wang (1983), Confining mycelial growth to porous microbeads : a novel technique to alter the morphology of non-newtonian mycelial culture, Biotechnol. Bioeng., 25, 967-983