키틴과 단백질이 패각변성에 미치는 영향

용동희,  신나영,  최청송

서강대학교 화학공학과

Effect 0of Chitin and Protein on Deforming Shell

Dong-hee Yong, Na-young Shin, Cheong-song  Choi

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

연체동물에서 생물학적으로 생성된 패각 결정은 대부분 탄산칼슘으로 이루어졌으며 성장 환경에 따라서 고유의 결정 구조 특성, 형태 및 기계적 성질들이 조절된다. 광물화 과정을 통해 기관이 형성될 때 가장 중요한 인자로 인식되는 것은 조직에 침투되어 있는 유기 매트릭스이며 이러한 유기 매트릭스는 주로 결정내부 단백질과 다당류로 이루어져 있다. 결정내부 단백질과 다당류는 연체동물의 패각 결정 형성시 고체구조의 특이성을 결정하고 calcification과정에서 미세한 구조적 골격을 이룬다. 그러나 현재까지 무기물층과 유기 매트릭스사이에 구조적 관계가 명확하게 밝혀지지는 않았다.

식물이나 동물의 뼈대를 구성하는 기본적인 다당류 고분자는 셀룰로즈, 키틴과 콜라겐들이다. 키틴은 하등 동물 중 특히 절지 동물에 많이 포함되어 있고 생합성되는 양은 년간 수십억톤으로 아미노다당 중에서 가장 많은 양으로 추정되고 있다. 특히 연체동물이나 인간의 골격에서 보이는 공통점은 서로 다른 화학성분(탄산칼슘과 수산화인산칼슘)으로 구성되어 있지만 구조적 특성은 합판 형태를 갖춘 것이다. 패각에 존재하는 키틴은 결정내부 단백질과 결합하여 뼈대구조를 형성한다고 보고되었으며 이러한 단백질과 키틴을 분리 정제하여 분석함으로서 패각 조직이 형성 될 때 또는 정상 패각에서 변형 패각으로 변형할 때의 영향을 고찰하였다.

실험 재료 및 방법

1) Materials

패각을 wire brush로 세척한 후 5% 수산화나트륨 용액에 72시간 함침하고 증류수로 세척하여 표면의 흙, 기타 유기물질을 제거하였다. 완전 건조시킨 후 microgrinder를 이용하여 패각의 바깥층과 눈알층을 분리하고 습식 처리를 이용하여 중간층과 안층을 분리하였다. 이렇게 분리된 시료 30g과 50ml 증류수를 혼합한 투석액을 10L, 2% 초산으로 투석하였다. 이때 추출용매인 초산은 물론 투석액도 잘 섞이게 하기 위해서 투석 튜브를 회전축에 장착하여 회전시키면서 투석하였다. 패각이 완전히 녹은 후 원심 분리기를 이용하여 가용성 단백질과 불용성 단백질로 분리하고 이것을 초순수를 이용하여 재투석하였다. 또한 불용성 단백질을 5% 수산화나트륨 용액에 교반시킨 후 원심분리기를 이용하여 경단백질과 키틴으로 분리하였다.

2) 아미노산 조성 분석

동결 건조된 단백질을 100[eqn: mu]l증류수에 현탁한 후 20[eqn: mu]l씩 취하여 완전히 말린다. 시료를 110[eqn: DEG]C에서 24시간 동안 6N염산을 이용하여 진공에서 가수분해한다. 가수분해된 아미노산을 PITC로 유도체화시킨다. 시료를 완전히 말린 후 pH 6.3,200[eqn: mu]L의 1.4mM NaHAc,0.1% TEA,6% CH3CN에 녹인다. 원심분리 후 상층액을 각각 50[eqn: mu]L씩 따서 합쳐 섞은 후 FPLC의 autosampler에 장착한다. 컬럼은 PicoTag이며 Photodiode array detector를 사용하였으며  60% CH3CN으로 선형 그래디언트를 사용하였고 beckman 6300 아미노산 분석기를 이용하여 수행하였다.

3) SEM

각 층에서 분리된 불용성 단백질과 키틴을 분리하기 전의 상태를 SEM을 통해서 표면을 관찰한다. 또한 불용성 단백질과 키틴을 분리한 후의 키틴만의  표면도 SEM을 통해 살펴본다. Shell의 측면의 표면도 살펴보기 위해서 shell을 고분자로 코팅하여 투석한 후 측면의 표면도 SEM을 통하여 관찰한다.

4) Vickers Microhardness

정상 패각과 변형 패각의 안층을 분리하여 시편을 제작한다. 각각의 시편당 5개의 위치를 잡고 200g의  하중으로 15초 조건으로 측정한다. 측정한 값을

[eqn: Hv~ =~ { P} over {A }~ =~ { 2P sin theta } over { { d}^{2 } }]

=  1.8544[eqn: { P} over { { d}^{2 } }]

= 1854.4[eqn: { P} over { { d}^{2 } }]

의 식을 이용하여 구할 수 있다.

결과 및 고찰

결정 내부 단백질의 아미노산 조성 분포를 정상 패각과 변형 패각을 비교해 보았을 때, 변형 패각에서 정상 패각 보다 약 7% 적은 산성 아미노산의 함량을 보였다. Asp와 Glu의 산성아미노산은 칼슘이온과 결합하여 판상 형태의 패각 조직을 형성하는데 기여하지만 변형패각에서의 적은 함량은 칼슘 이온의 결합 상태의 변화를 초래하는 것으로 보인다. 패각의 변성 시 염기성 아미노산의 함량 변화가 없었으나 비극성과 중성의 아미노산의 함량은 변화의 폭이 상대적으로 심했다. 패각의 뼈대 구조를 형성하는 것으로 알려진 불용성 단백질 중 비극성 아미노산의 함량이 증가하며 중성 아미노산의 함량이 뚜렷하게 감소하는 경향을 보였다.

변성 패각에서의 경단백질은 정상 패각과 비교하였을 때 Gly의 함량이 낮았으며 Pro의 함량이 증가하였다. 이 결과는 경단백질의 아미노산 조성변화를 동반한 구조변화를 의미하는 것이다. 또한 뼈대구조를 형성하는 단백질과 키틴을 연결하는 serine은 정상적인 패각에서는 20%의 함량을 보였으며 변성패각에서는 3%의 함량을 보였다. 이것으로 보아 변성 패각에서는 유기매트릭스와 칼슘이온의 결합 상태에 변화가 있었으며 경단백질의 아미노산 조성변화를 통해 키틴과 함께 형성하는 패각의 뼈대구조의 변화를 예측할 수 있다.

정상패각과  변형패각 조직에 함유된 키틴과 경단백질의 함량을 비교해 보았을 때 정상 패각의 키틴 74%, 경단백질 59%의 함량이 감소되었음을 알 수 있다. 또한 중간층과 바깥층에서는 뚜렷한 차이점을 발견할 수 없었으나, 안층에서는 키틴과 경단백질의 결합형태에서부터 함량의 차이까지 뚜렷한 차이를 보였다. 그림 1에서 보듯이 정상패각의 안층은 키틴과 경단백질이 벌집 모양을 유지하며 조밀한 구조를 가지고 있는 반면, 변형 패각의 안층은 키틴과 경단백질의 결합 모양이 벌집모양이 해체된 상태를 보이고 있다. 이것으로 serine의 감소로 인한 경단백질과 키틴의 결합 상태의 변화를 예측할 수 있다. 키틴과 경단백질 사이의 변화에 따른 강도를 측정하기 위해서 비커스 경도계를 이용하여 강도를 비교한 결과 정상패각의 안층이 (491.3kgf /[eqn: { mm}^{2 }] ) 변형 패각의 안층(232.0 kgf / [eqn: { mm}^{2 }])보다 두 배의 강도 세기를 가지고 있었다.

패각 조직에서 사라진 키틴과 경단백질은 각 층과 층 사이에서 키틴막 형태로 독립적으로 존재하고 있으며 층 사이에서 분리할 때 키틴막은 얇은 중간층으로 덮여있다. 이 막은  키틴과 소량의 경단백질로 이루어져있으며 이때 분리된 키틴막을 IR 스펙트럼으로 측정하였을 때, 키틴의 특성밴드인 1650[eqn: { cm}^{-1 }]과 1558[eqn: { cm}^{-1 }]을 보이고 있다.

또한 키틴막에 존재하는 경단백질의 아미노산조성이 함량 비극성그룹, 산성그룹, 염기성그룹, 중성그룹으로 냈다. 이러한 아미노산 분포는 변형패각 경단백질의 조성 분포와 매우 흡사하며 위 결과는 패각의 뼈대조직에 존재하는 키틴과 경단백질이 변성과 더불어 패각조직에서 빠져 나와 층과 층 사이에 존재하며 뼈대구조의 변형을 유발하여 패각의 취성을 유발한다고 생각된다.

이와 같이 구조적 골격을 형성하는 경질단백질에서 아미노산조성 분포의 차이와 더불어 패각 조직에서 키틴 함유량의 감소는 패각과 생체 복합재의 파괴인성 변화와 관련있을 것으로 생각된다.

(A)      (B)

(C)       (D)

(E)        (F)

그림1. 각 층의 키틴과 단백질의 표면 상태 SEM  (A) N-inner (B) D-inner

(C) N-center  (D) D-center  (E) N-outer  (F) D-outer

참고문헌

1. Berman A. : Science, 250, 664-667 (1990)

2. Given RK. : Eur J Biochem,  193, 409-420 (1990)

3. Madeleine : Current opinion in solid state & materials science , 3, 221-227(1998)

4. Shimahara K. : Methods Enzymol.  161, 417-423 (1988)

5. Weiner  S. : Phil Trans R Soc Lond , b304, 425-434 (1984)