RP-HPLC에서 완충용액의 농도에 관한 체류모델에 관한 연구

이주원, 홍승범, 최대기*, 노경호

인하대학교 화학공학과

*환경복원센터, 한국과학기술연구원

Study on Retention Models with Buffer Concentrations in RP-HPLC

Ju Weon Lee, Seung Bum Hong, Dae Ki Choi*, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha Univ., Inchon 402-751, Korea

*Environment Remediation Center, KIST, Seoul, 136-791, Korea

서론

Nucleotides는 생명체의 유전 물질인 DNA의 구성물질로 핵산염기, D-ribose, 인산 3종류의 분자가 결합한 핵산을 구성하는 기본단위이다. Nucleotides는 nucleosides의 3'또는 5'에 인산이 에스테르 결합으로 연결된 구조를 가지고 있다. Nucleotide의 유도체중 특히 adenosine-5'-triphosphate (ATP)는 생화학반응에서 중요한 작용을 한다[1].

Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography(RP-HPLC)는 용액 상태의 혼합물을 분석하는 대표적인 분석기기로 많은 활용범위가 연구되고 있다[2]. RP-HPLC에서 이동상은 물과 물보다 낮은 극성을 가지는 메탄올, 아세토나이트릴이 주로 사용된다. 이러한 이동상에 용해되는 물질은 주로 극성을 띄거나 용해되어 이온으로 존재한다. 고정상으로 쓰이는 물질은 비극성을 띄는 C18이나 C8을 사용한다. 용해되어 이온으로 존재하는 물질은 매우 큰 극성을 보이기 때문에 비극성인 고정상에 체류하지 않고 바로 용출되어 분석을 어렵게 한다. 이동상의 pH에 따른 시료의 체류거동에 따른 연구는 많은 연구자에 의해서 발표되었다[3]. 그러나 이동상의 pH를 측정하는 것이 매우 어렵고 매 실험마다 동일한 pH를 얻기가 어렵다. 또한 buffer의 종류에 따른 체류거동의 변화를 알 수 없다. 이러한 어려움을 해결하기 위하여 본 연구에서는 이동상의 pH의 변화를 대신하여 이동상 내의 buffer의 농도의 변화에 따른 시료의 체류거동을 예측함으로써 buffer의 농도가 이온성 시료의 체류에 미치는 영향을 연구하여 buffer의 농도에 따른 시료의 체류거동을 규명하는 것이다[4].

본 연구의 목적은 다섯 가지 nucleotides, cytidine-5'-monophosphate disodium salt (5'-CMP), uridine-5'-monophosphate disodium salt (5'-UMP), guanosine -5'- monophosphate disodium salt (5'-GMP), inosine-5'- mono phosphate disodium salt (5'-IMP), adenosine-5'-monophosphate disodium salt (5'-AMP)의 체류거동을 물 - 메탄올의 이성분계 이동상에 sodium phosphate monobasic 또는 acetic acid를 첨가하여 buffer의 농도에 따른 체류거동을 예측하기 위한 모델식을 구하는 것이다.

이론

고정상이 비극성을 띄고 있으므로 이온으로 용해되어 있는 물질은 고정상에 거의 체류하지 않는다. 용해되어 음이온으로 존재하는 물질이 비극성 column에 쳬류할 때의 체류인자(k)는 다음과 같이 이온으로 존재할 때의 체류인자(k-)와 비이온으로 존재할 때의 체류인자(k0)의 합으로 나타낼 수 있다.

[eqn: k = k_0 ( 1 - F_- ) + k_- F_-]	(1)

여기서 F-는 이동상 내에서 이온으로 존재하는 시료의 몰분율이다. 시료가 이동상에 용해되어 +1가의 이온을 내보내고 -1가의 이온으로 존재하는 경우의 F-는 다음과 같이 표현할 수 있다.

[eqn: F_- = { 1} over {1+LEFT [ C^+ RIGHT ] / K_S }]	(2)

여기서 KS는 시료의 이온화 상수이고 SC는 비이온을 띄는 시료의 구조식을 대표하며 S-는 음이온의 구조식을, C+는 양이온의 구조식을 대표한다.

식 (1)에 식 (2)을 대입하면 아래와 같은 식을 얻을 수 있다[4].

[eqn: k = { k_0 LEFT [ C^+ RIGHT ] /K_S + k_- } over { 1 + LEFT [ C^+ RIGHT ] /K_S }]	(3)

미량의 시료를 주입했을 경우에 C+는 buffer에 의해서만 제공된다고 가정할 수 있다. [C+]의 농도를 이동상 내의 buffer의 농도에 대한 함수로 나타낼 수 있다.

[eqn: LEFT [ C^+ RIGHT ] = K_1 C_B]	(4)

[eqn: LEFT [ C^+ RIGHT ] = K_2 SQRT { C_B }]	(5)

식 (4)과 식 (5)에서 CB는 이동상 내에서의 buffer의 농도이고 K는 실험 상수이다. 식 (4)과 식 (5)을 식 (3)에 대입하면 buffer의 농도에 따른 체류인자의 함수 식을 얻을 수 있으며 다음과 같다.

[eqn: k = { {k_0 K_1} over K_S C_B + k_- } over { 1 + K_1 over K_S C_B }]	(6)

[eqn: k = { {k_0 K_2} over K_S SQRT { C_B} + k_- } over { 1 + K_2 over K_S SQRT { C_B}}]	(7)

위의 식 (6)과 식 (7)는 이동상 내에서 buffer의 농도에 따른 체류인자의 변화를 나타내는 식을 제안하였다. 윗식에서 포함된 네 가지 매개변수 k0, k-, K1/KS, K2/KS는 비선형 회귀분석에 의하여 구하였다.

실험

본 실험에서 사용된 nucleotide는 cytidine-5’-monophosphate disodium salt(5’-CMP), uridine-5’-monophosphate disodium salt(5’-UMP), guanosine-5’-monophosphate disodium salt(5’-GMP), inosine-5’-monophosphate disodium salt(5’-IMP), adenosine-5’-monophosphate disodium salt(5’-AMP)로 Fluka에서 구입하였으며 이동상으로 쓰인 물은 증류장치로 증류하여 ULTRA-PURE WATER SYSTEM Milli-Q50 (Millipore)를 이용하여 18M□cm의 초순수를 만들어 사용하였으며 메탄올은 HPLC-grade를 J. T. Baker에서 구입하여 사용하였다. 이동상의 pH를 조절하기 위해서 사용된 두 가지 buffer는 acetic acid, sodium phosphate monobasic이다. HPLC column은 0.39□30cm의 empty column에 Lichrospher 100 RP-18(15□m, MERCK) packing을 충진하여 사용하였다.

HPLC는 Waters사의 616 pump와 600S controller, 2487 detector를 사용하였다. 유속은 1□/min으로 고정하였고, 이동상내의 메탄올의 조성은 5, 10, 15, 20 vol.%로 변화시켰다. 이동상 내에 buffer의 농도는 acetic acid의 경우 0.08734에서 9.78251mM로 변화하여 실험하였고, sodium phosphate monobasic은 0.0099에서 8.992mM로 변화하며 실험하였다. Sample은 150ppm의 수용액을 만들어 20□를 주입하였다. 모든 실험은 상온에서 행하였다.

결과 및 고찰

식 (6)과 식 (7)는 이동상 내의 buffer의 농도에 따른 시료의 체류인자를 결정하는 model 식으로 Fig. 1은 다섯 가지의 5□-nucleotides에 대해서 buffer로 acetic acid를 사용하였을 때의 실험 값과 식 (6)과 식 (7)에 의해 계산된 계산 값을 나타낸 것이다. Fig. 1에서 볼 수 있듯이 acetic acid의 농도가 4 mM이상의 경우에는 각 물질에 대한 체류인자가 일정한 값을 보이고 있음을 실험 값으로 알 수 있다. 이러한 특성을 식 (6)은 acetic acid가 4 mM 이상의 구간에서 수렴하는 값을 잘 나타내고 있지만 식 (7)에 의해서 계산된 값은 acetic acid의 농도가 4 mM이상인 구간에서 일정한 값으로 수렴하는 경향이 아닌 서서히 증가하는 경향을 나타내고 있다. Fig. 1에서 보이는 바에 의해서도 acetic acid의 경우 식 (6)의 계산 값이 식 (7)의 계산 값 보다 잘 일치하고 acetic acid의 농도의 변화에 따른 체류인자의 변화도 잘 표현하고 있음을 알 수 있다. Fig. 2는 이동상 내에 sodium phosphate monobasic이 buffer로 들어가 있을 경우에 sodium phosphate monobasic의 변화에 따른 체류인자를 실험 값과 계산 값에 대하여 표시한 것이다. Acetic acid의 경우와는 대조적으로 이 경우에는 sodium phosphate monobasic의 농도가 증가하여도 체류인자는 일정한 값으로 수렴하는 경향이 아닌 계속 증가하는 경향을 보이고 있다. 식 (6)은 sodium phosphate monobasic의 농도가 증가할수록 체류인자가 증가하는 경향을 잘 나타내지 못하고 sodium phosphate monobasic의 농도가 증가할수록 실험 값보다 낮은 계산 값을 보이고 있으나, 식 (7)는 monobasic의 농도가 증가할수록 증가하는 실험 값을 식 (6)보다는 잘 표현하고 있다.

본 연구에서는 buffer의 종류에 따라서 다른 모델식을 적용함으로써 pH에서 고려되지 않은 buffer의 종류에 따른 특성을 고려하였다. Acetic acid의 경우에는 식 (6)이, sodium phosphate monobasic의 경우에는 식 (7)이 잘 일치하고 있다.

알림

본 연구는 인하대학교 고순도분리연구실에서 수행되었습니다.

참고문헌

1. Shuler, M.L. and Kargi, F. : "Bioprocess Engineering", Prentice Hall, London(1992).

2. Lee, Y.W., So, M.S., Lee, J.W., Chung, S.T. and Row, K.H. : Korean J. Chem. Eng., 13, 578(1996).

3. Bosch, E., Bou, P., Allemann, H., and Roses, M. : Anal. Chem., 68, 3651(1996).

4. Hajnos, M.W. : Journal of Chromatography B, 717, 93(1998).

Fig. 1 Comparison of calculated and experimental retention factor

( acetic acid, solid : Eq. 6, dash : Eq. 7 )

Fig. 2 Comparison of calculated and experimental retention factor

( sodium phosphate monobasic, solid : Eq. 6, dash : Eq. 7 )