결정화 방법을 이용한 고순도 공역화 리놀레인산의 분리 정제방법

홍준기, 한유리, 이성권 최청송

서강대학교 화학공학과

Separation and purification method for preparing highly purified conjugated linoleic acid using crystallization process

Jun-Kee Hong, Yu-ri Han, Seong-Kweon Lee, Cheong-Song Choi

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

공역화 리놀레인산은 항돌연변이 작용뿐만 아니라, 피부암, 전위부 종양, 유선암, 대장암 억제 또는 감소 효과가 있다고 알려져 있다. 최근에는 공역화 리놀레인산이 암 연구 이외에 동맥경화증(arteriosclerosis)을 완화하는 작용이 있으며, 포도당에 대한 내성을 저하시켜 당뇨병 치료효과가 있으며 비만(obesity)을 억제한다고도 알려져 있다. 공역화 리놀레인산(Conjugated linoleic acid, CLA, octadecadienoic  acid; c18:2)은 모든 탄소수가 18개이며, 두 개의 이중 결합을 갖는 리놀레인산의 구조(시스-9(cis-9), 트랜스-11(trans-11))로부터 9, 11 또는 10, 12 또는 탄소의 위치 및 기하(시스-, 트랜스-) 이성체를 통칭한다.  공역화 리놀레인산은 시스/트랜스-CLA (cis/trans-CLA)와 트랜스/트랜스-CLA(trans/trans-CLA)로 구분할 수 있다. 되새김질 동물의 되새김위 내에서 생성되는 CLA는 일반적으로 시스/트랜스-CLA로서 주로 시스-9, 트랜스-11의 구조를 갖는다고 보고된 바 있다.[1.2]

따라서, 본 연구는 이러한 공역화 리놀레인산의 고순도 분리정제를 위해 메탄올 : 요소 : 리놀레인산을 고농도로 함유한 식물유(홍화유, 해바라기씨유 등)의 원료를 3∼4 : 1.5∼2.0 : 1 비율로 혼합시킨 혼합물을 60∼70℃로 승온시켜 완전용해 시킨 후, 냉각시켜 최종온도를 20∼30℃로 조절하고, 수득된 혼합물을 여과하여 액상분을 회수하고 메탄올을 증발시킨 후, 이때 수득된 결정체에서 요소와 헥산을 제거시킴을 특징으로 하는 순도 99% 이상 리놀레인산의 분리 정제 방법을 제공하는 것과 상기 방법으로 수득된 순도 99% 이상의 리놀레인산을 고온 염형성이성질화방법(AOAC 방법에 준함)에 의하여 공역화 리놀레인산으로 전환시키고, 전환 후 발생된 부산물인 과산화물과 색소성분 등을 제거하고, 공역화 리놀레인산 : 요소 : 메탄올을 7∼9 : 2.5∼3.5 : 1 비율로 혼합시킨 혼합물을 60∼70℃로 승온시켜 완전 용해시킨 후, 최종온도를 0∼10℃로 냉각시키면서 공역화 지방산을 2∼8회 분할 주입하고 메탄올을 증발시킨 후, 이때 수득된 결정체에서 요소와 헥산을 제거시킴을 특징으로 하는 순도 99% 이상의 공역화 리놀레인산의 분리 정제 방법 및 이중 생리 활성에 효과가 있다고 알려진 9번과 11번의 시스-시스 이성질체를 99% 이상으로 분리 정제히는 방법을 규명하는 것이다. 또한 본 연구의 내용은 현재 특허에 츌원 중이다.[3,4,5]

고순도 Linoleic Acid 정제

해바라기씨유에는 대략 67.5%의 리놀레인산을 포함하고 있고 또한 값도 싸 고순도 리놀레인산의 분리정제에 적합하다.

본연구에서는 고순도의 리놀레인산을 분리해 내기 위해 리놀레인산의 지방산 전환과 두차례의 요소포접을 수행하였으며 이를 통해 99%의 리놀레인산을 분리할 수 있었다.

요소포접을 이용해서 지방산을 분리해 내는 방법에는 요소수용액이나 요소-알코올 용액와 지방산의 혼합용액을 냉각하여 요소가 결정화 되면서 지방산을 포접하는 방법을 이용하였다.

이러한 요소포접화합물법의 첫 공정에서는 탄소 수가 적고 이중결합이 없거나 하나인 팔미트산(palmitic acid)과 스테아린산(stearic acid)등을 먼저 포접해 분리해내고 두 번째에는 리놀레인산 보다 포접이 어려운 리놀레닌산(linolenic acid)을 리놀레인산과 분리하였다. 이렇게 분리정제된 리놀레인산의 분석은 gas chromatography (HP5890)로 하였으며 그 결과는 표1에 나타나 있다.[2]

Chart 1. Composition of

sunflower oil

fatty acid	composition
Palmitic acid	5.9
Stearic acid	4.4
Oleic acid	19.0
Linoleic acid	67.5
Linolenic acid	0.4

CLA의 합성

리놀레인산을 함유한 지방산이나 중성지질의 공역화는 AOAC 방법에 준하여 실시했다.   먼저 에틸렌글리콜(1□)을 180℃로 승온후 KOH(250g)을 서서히 주입하여 완전 용해시킨 후 지방산이나 중성지질(500g)을 주입하여 1시간 30분 염화 시킨다. 반응이 종결되면 상온까지 냉각한 후 메탄올(500□)을 넣고 진한 염산을 주입하여 pH 4로 적정하여 지방산으로 전환한다. 그 후 물(500□)과 헥산(500□)을 넣고 30분간 교반하며 상층부의 헥산층으로 지방산을 이동시킨다.   그 후 이 혼합액을 정치시키고 상층부를 물로 2∼3회 세정 후 상층부의 지방산층을 회수하여 회전 진공 증발기로 헥산을 제거한 후 -20℃에서 보관한다.[2]

CLA의 고순도 분리

메탄올(4.5□)과 요소(1.5□)를 70℃에서 완전 용해시킨 혼합액에 2∼8회 분할 주입시키면서 0.2℃/분으로 10℃까지 냉각시킨 후 여과한다. 그 후 결정체를 헥산(1□)으로 세정한 후 여과한다. 이 결정체에 다시 물(500□)과 헥산(500□)을 넣고 진한 염산을 소량 주입 후 20분간 교반 후 정치시킨다.   여기서 상층부액을 회수하여 진공 회전 증발기로 헥산을 제거시키면 고순도의 무색 무취의 공역화 리놀레인산 450g 정도를 얻을 수 있다.

cis-9 cis-11 CLA의 고순도 분리

기존의 공역화 방법 중 공역화 시간을 1시간 반에서 5시간 정도로 연장시키면 CLA 중 시스-9, 시스-11의 조성이 10% 정도로 증가하게 된다. 이렇게 제조된 CLA(100g)에 헥산(500□)을 넣고 40℃로 승온시키면서 완전 용해시킨다. 그 후 이 혼합액을 상온까지 교반을 하지 않는 정치상태에서 방냉한다. 상온 근처부터 결정이 석출되면 상온과 평형이 될 때까지 방치한다.   평형이 되었을 때 여과를 한다. 여과 후 결정체를 헥산으로 2∼3회 세정한 후 건조한다.   이렇게 해서 얻어진 결정체의 지방산 조성은 시스-9, 시스-11 CLA (99.17%)으로 약 7g 정도의 백색 결정을 얻을 수 있었다.

결과

연구결과 각 시료(Conjugated Linoleic acid 와 cis-9 cis-11 CLA)의 조성은 다음과 같다.

Conjugated Linoleic acid 의 조성은 시스-9, 트랜스-11 CLA (48.8%); 트랜스-10, 시스-12 (44.3%); 시스-9, 시스-11 (1.4%); 시스-10, 시스-12 (3.6%); 트랜스-9, 트랜스11 (0.6%); 트랜스-10, 트랜스-12 (0.3%); oleic acid (0.5%); linoleic acid (0.2%) 이 었다.

cis-9 cis-11 CLA 의 조성은 시스-9, 트랜스-11 CLA (0.83%); 시스-9, 시스-11 CLA (99.17%) 이 었다.

참고문헌

1. Pariza. M. W. and Hargraves. W. A., A beef derived mutagenesis         modulator inhabit initiation of mouse epidermal tumors by               7,12-dimethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 6, 591(1985)

2. Ip. C., Chin. S. F., Scimeca. J. A. and Pariza. M. W., Mammary          cancer prevention by conjugated dienoic derivative of linoleic acid,        Cancer Res., 51, 6118(1991)

3. Benzamin. H., Strokson. J. M., Albright. K., and Pariza. M. W.,           TPA mediated introduction of ornithine decarboxylasc activity in        mouse forestomach and its inhibition by conjugated dienoic              derivatives of linoleic acid, FASEB J., 4, 140(1990)

4. Haagsma, N., Van Gent, C. M., de Jong, R. W. and van Doorn, E.,        JAOCS, 99,117 (1982)

5. Bengen, F., German Patent Appl. oz 12438 (1940)

fig. 1 Conjugated Linoleic acid

fig. 2 cis-9 cis-11 CLA