CO로부터 수소를 생성하는 미생물의 분리와 배양

박성훈1,2·이태호2·정규열2·김중래1·정현옥1·박지영1

부산대학교 응용화학공학부1, 환경기술·산업개발 연구센터2

Isolation and Cultivation of Novel Bacteria Catalyzing

Water-gas Shift Reaction

Sunghoon Park,1,2 Tae Ho Lee,2 Gyoo Yeol Jung,2 Jung Rae Kim,1

Hyun Ok Jung,1 Ji-Young Park1

Division of Chemical Engineering, Pusan National University1

Institute for Environmental Technology and Industry, Pusan National University2

서론

CO는 산업체 부생가스의 중요한 구성성분으로 유독성기체이다. 그러나 완전 산화물이 아니므로 생물학적으로 수소, acetate, 혹은 에탄올을 생산하는데, 쓰일 수 있다(1). 이중 수소는 수성가스 개질반응 (water-gas shift reaction)에 의해 생산되는데, 비교적 자세히 연구되었다.

[eqn: CO ~+~ H_2 O ~→~ CO_2~ +~ H_2 ~~~~:~~~~Delta G^o ~=~-20.1``KJ``mol^-1]

위 반응은 촉매의 성능에 크게 좌우되며 따라서 적절한 미생물 촉매를 개발하고자 하는 노력이 많이 보고되었다. 광합성 세균인 Rhodospillum rubrum, Rhodopseudomonas gelatinosa, Rhodobacter sp. 등을 비롯하여 절대 혐기성균인 Methanosarana barkeri 등이 비교적 많이 연구되었다(2). 특히 광합성 세균인 R. rubrum은 CO 소모속도가 높고 수소전환 수율이 1.0에 가까우므로 많은 주목을 받았다. 그러나 R. rubrum은 CO를 탄소원으로 하여 자랄 때는 속도가 느리고 또 0.2 atm 정도의 높지 않은 CO 분압에서 수소생산활성에 저해를 받는 것이 밝혀졌다. 더구나 광합성 세균의 경우 빛 전달의 제한 때문에 고농도배양이 어렵고 scale-up에 한계가 있으므로 산업적 적용이 곤란하였다. 한편 절대 혐기성균은 다루기 어려울 뿐 아니라 매우 느리게 자라므로 역시 산업적 적용에 한계가 있었다.

최근 기존의 미생물이 갖는 단점을 극복할 수 있는 새로운 균주가 연구되었다. Rhodopseudomonas palustris P4(3) 와 Citrobacter sp Y19(4)이 이들인데, 본 논문에서는 이들이 분리, 동정, 특성파악, 수소생산에의 적용 등을 기술한다. 특히 미생물의 분류학상 위치 및 이미 알려진 일반적 성질이 새로운 미생물의 배양과 수소생산 활성 최적화에 많은 도움이 될 수 있음을 다룬다.

본론

가. 미생물의 분리 및 동정

산업적으로 유용한 수소생산균은 기본적으로 다음 몇 가지 성질이 필요하다.

·성장속도가 빠르고 고농도 배양이 가능할 것

·수소생산활성이 높고 전환 수율이 높을 것

·활성의 안정성이 오래 지속되고 고농도 CO 에도 잘 견딜 것

이러한 성질을 만족하려면 통성혐기성 화학종속영양세균(facultative anaerobic, chemoheterotrophic)을 분리하는 것이 바람직하다. 그러나 CO 전환 균주로 통성혐기성 화학종속영양세균이 아직 알려져 있지 않았으므로 본 연구에서는 첫째, 광합성 미생물중  R. rubrum 보다 우수한 균주를 분리하고자 하였고, 둘째, 가능성은 낮지만 통성혐기성 화학종속세균을 분리해 보고자 하였다. 미생물원으로는 탄소대사관련 다양한 미생물군이 포함된 혐기성 폐수처리 소화조를 선택하였다.

광합성 미생물을 분리하기 위해 탄소원이 거의 결핍된 빈영양 액체배지에 폐수처리 슬러지를 넣고 백열등하에서 CO-Ar(20:80 v/v) 아래서 혐기적으로 배양하였다. 수 차례 같은 조건에서 계대배양을 행한 후 고체 배지에 도말하여 백열등과 CO 존재하에서 배양하였다. 수종의 붉은색 군락이 얻어졌고 가장 성장이 빠른 군락을 선택하여 순수 분리하였다. 한편 통성혐기성화학종속균은 빛이 차단된 상태에서 유기탄소원과 질소원이 포함된 배지를 사용 CO-Ar(20:80 v/v) 하에서 수 차례 집적배양을 행하였고, 고체배지에 도말한 후 역시 CO-Air 조건에서 배양한 결과 수종의 군락이 발견되었다. 이중 성장이 빠른 군락을 선택하고 순수 분리하였다.

미생물이 분리된 후 이들의 산업적 유용성, 즉 CO로부터 생산하려는 최종목적에 얼마나 부합되는지 알아보는 것이 필요하다. 즉 여러 가지 조건에서 성장과 수소 생산을 조사하여야 한다. 그러나 균주의 신규성을 확인하고 또 분리된 균주의 분류학적 특성으로부터 일반적 성징을 조사하여 산업적 가능성을 추정하기 위해 먼저 이들을 동정하였다. 생태학적, 생화학적 특성과 16s rDNA analysis를 이용한 결과 광합성 세균은 Rhodopseudomonas palustris로 밝혀졌고 R. palustris P4로 명명하였다. 또한 통성혐기성 화학종속 세균은 Citrobacter로 밝혀졌고, Citrobacter Y19으로 명명하였다.

Rhodopseudomonas 는  Rhodospillum과 함께 □ proteobacteria 에 속하고 anoxygenic phototrophic bacteria로 알려져 있다. 이들은 광합성중 물이 아닌 전자공여체(주로 H2, H2S, S, malate, acetate, pyruvate등)를 사용하므로 산소를 생산하지 않으며 광합성시에는 혐기성장을, 그리고 유기탄소원을 이용할 때는 호기 성장을 하는 등 매우 다양한 energy metabolism을 가지고 있다(5). CO 의 소모 및 H2 의 생산도 에너지 대사와 관련이 있으므로 P4의 배양 및 수소생산활성 조건도 경우에 따라 매우 다른 양상을 보일 것이 예상된다. 한편 Citrobacter는 Escherichia coli와 함께 □ proteobacteria 에 속하고 호기적 조건에서는 respiratory respiration을, 그리고 혐기적 조건에서는 fermentative metabolism을 하는 전형적인 통성혐기성균이며 역시 에너지 대사의 다양성을 갖고 있다. Y19은 통성혐기성균중 특히 □ proteobacteria중에서 수성가스 개질반응을 촉매하는 최초의 균주이다.

나. P4의 배양 및 수소생산 활성

P4는 혐기상태에서 빛을 에너지원으로 그리고 CO를 탄소원으로 잘 자랐다. 그러나 수소생산활성은 빛이 없는 상태에서 나타났다. 즉 빛이 있는 상태에서 CO가 균체 성장에 소모되나 수소의 축적은 관찰되지 않고, 반면 빛을 제거하면 균체 성장은 더 이상 관찰되지 않으나 소모된 CO의 몰수만큼의 수소가 생성되었다. 광합성 성장시 균체의 배가시간은 약 2시간이었고 최대 수소생산활성은 약 20 mmol/g cell·h 였으며, 이러한 높은 활성은 약 400시간 이상 장시간 지속되었다 (Table1). 이러한 결과는 지금까지 최적 균주로 알려진 R. rubrum 보다 훨씬 뛰어난 성능이다. 또한 성장에 미치는 빛과 산소의 영향으로부터 P4가 anoxygenic phototrophic bacteria 의 전형적인 성격을 따르고 있음을 알 수 있다. 뿐만 아니라 균체의 성장조건과 수소의 생산조건이 매우 다르기 때문에 각각의 조건이 별도로 최적화 되어야 함을 알 수 있었다.

P4의 성장 및 수소생산을 광합성 성장조건을 중심으로 최적화 할 수 있다. 즉 혐기, 광합성, 탄소원, CO 조건에서 온도, pH, 빛의 세기, CO 농도, 배지성분, 배양시간 등을 달리하면서 성장속도를 측정하고 암조건으로 배양액을 옮긴 후 이들 환경요인들을 변화시키면서 수소생산활성을 조사할 수 있다. 그러나 앞서 언급한 대로 P4가 Rhodopseudomonas로 전형적인  anoxygenic phototrophic bacteria의 성질을 나타내므로, 빛이 없는 상태의 성장과 후속적인 수소생산을 시도하여 보았다(Table 2).

Table 1. Characteristics of hydrogen producing bacteria from CO

Strain	Light requirement		Max. H2 production rate (mmol·gcell-1·hr-1)	Doubling time (h)	Reference
	Growth	H2 production
R. rubrum	Yes	Yes	11	∼10hr	[6]
R. palustris P4	Yes	No	20	∼2hr	This study[3]
Citrobacter sp. Y19	No	No	33	∼1hr	This study[4]

예상대로 빛이 없는 상태에서 호기적 화학종속 성장 및 혐기적 화학종속 성장이 가능하였다. 뿐만 아니라 호기성장상태에서 훨씬 빠른 성장속도와 높은 세포농도가 얻어졌고, 비슷한 수준의 수소생성활성을 보였다. 이러한 결과는 생물 반응기 실험에서도 확인되었다. 특히 배지조성을 최적화하고 유가배양을 실시한 결과 24시간 이내에 약 15 g/L의 높은 세포농도를 얻을 수 있었다.

Table 2. Flask cultivations of Rhodopseudomonas palustris P4 under anaerobic

and anaerobic conditions

Growth condition	Air/Light	Aerobic/(-)Light	Anaerobic/(-)Light	Anaerobic/(+)Light
	Carbon source	Sucrose(10g/L) and Y.E*(6g/L)	Sucrose(10g/L) and Y.E*(6g/L)	Y.E*(6g/L)
Growth charact- eristics	Doubling time(h)	1.0	1.8	2.0
	Cell density (g/L) at 24h	3.2	1.2	2.0
H2 production	Lag time **	60	0	10
	Specific H2 production activity(mmol/gcell/h)***	5.0	20	5.7

*Yeast extract

** H2 production was observed after a considerable amount of lag time when shifted to H2 production conditions

*** Measured under Pco=0.2 atm

Table 2. 의 결과로부터 각 배양조건이 서로 다른 장단점을 가지고 있음을 알 수 있다. 특히 빛이 없이 자랄 수 있다는 것은 P4가 □ proteobacteria에 속한다는 사실로부터 추정되는 성징이었지만 고농도 배양 및 scale-up에는 매우 중요한 장점이다. 애초에 광합성균을 분리하고자 의도하였으나 결국 통성 혐기성화학종속 영양균도 얻어진 셈이다. 그러나 호기성장 균체를 수소생산조건으로 전환하였을 때 장시간의 lag가 존재하므로 초기성장의 장점이 상쇄된다. Lag의 존재이유는 호기적인 영양종속성장조건에서 관련효소(CO dehydrogenase 및 CO-dependent hygrogense)의 발현이 억제되기 때문이다.

다. Y19의 배양 및 수소생산활성

P4가 광합성 조건에서 분리된 반면 Y19은 통성혐기성 화학종속균으로 분리되었다. Y19은 yeast extract와 bacto-tryptone이 첨가된 무기염 배지에서 배가시간 약 1h으로 빠른 호기 성장을 보였고 serum bottle 배양시 10시간 이내에 2 g/L 이상의 높은 세포농도를 보였다. 충분히 자란 균체를 혐기조건으로 옮겼을 때 CO로부터 수소생산활성이 약 33 mmol/g cell·h로 매우 높았다. 또한 활성 지속시간도 200여시간이 넘었다(Table 1). 그러나 bacto-tryptone 이 존재할 때 혐기 조건에서도 수소생성활성이 크게 저해되었다.

Y19은 빛을 필요로 하지 않고 높은 수소전환활성을 가지고 있으므로 산업적으로 응용가능성이 매우 높은 우수한 균주라고 판단되었다. 그러나 수소생산단계에서 baco-tryptone 이 완전히 소진되도록 하거나 혹은 배양액을 교체하여야 한다는 것이 단범이었다. 이를 해결하기위해 다양한 탄소원을 사용해 보았다. 그 결과 설탕이나 유탕과 같은 이탄당이 좋은 결과를 보인 반면 포도당은 bacto-tryptone과 비슷한 결과를 보였다. 이는 세포내  CO 전환시스템이 에너지 대사와 관련이 있고, E. coli등 다른 □ proteobacteria 처럼 Y19도 catabolite repression을 받기 때문으로 추정된다.

Y19의 수소생산 활성은 산소에 의해서도 repression 받았다. 또한 혐기조건으로 균체를 옮겼을 때 성장단계에서의 산소분압에 따라 수소 활성의 생산속도가 달랐다. 즉 DO가 높을수록 생성속도가 늦었다. 특히 생물반응기 배양에서 이러한 경향이 보다 심각하게 나타났다. 한편 Y19을 혐기조건 배양할 경우 성장단계에서도 수소활성이 나타났다. 그러나 성장속도가 매우 느리고 균체농도도 낮았다. Y19의 또다른 단점은 수소생성효소의 산소 민감성이었다. 산소에 노출될 경우 수소생성 활성은 매우 빠른 속도로 파괴되었고 한번 잃어버린 활성은 회복되지 않았다.

결론

수성가스 개질반응을 촉매하는 새로운 균주의 분리와 특징에 대해 요약하였다. 에너지대사와 관련이 있고 또 분리된 균주가 proteobacteria에 속하므로 성장조건과 수소생산 조건이 매우 다양하였다. 분리된 균주의 가장 큰 특징은 두 균주 모두 성장조건과 수소생산조건이 매우 다르다는 것이다. 여러 성질을 비교한 결과 두 균주중에서는 R. palustris P4가 보다 우수하였다. 본 연구의 결과는 향후 더 우수한 수소생산균을 분리하고 산업적 규모의 수소생산공정을 개발하는데 도움이 될 것이다.

감사의 글

본 연구는 산업자원부 연구비지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. R. L. Uffen. : Enzyme Microb, Technol., 3, 197(1981)

2. M. N. Davidova, N. B. Tarasova. F. K. Mukhitova, and I. U. Karpilova.: Can. J. Microbiol 40. 417(1994)

3. Jung G. Y., Jung H. O., Kim J. R., Ahn Y. H. and Park S. H. : Biotech. Lett. 21, 525(1999)

4. Jung G. Y.,  Kim J. R., Jung H. O., Park J-Y., and  Park S. H. : Biotech. Lett. 21, 869(1999)

5. R. M. Atlas.: "Princilews of Microbiology" 2nd ed. 888(1997)

6. J. P. Cowger., K. T. Klasson., M.D. Ackerson., E. C. Clausen., J. L. Gaddy.: Appl. Biochem. Biotechnol. 34, 613(1992)