구조적 분석을 통한 효소의 열안정성 연구

권태준, 유영제*

서울대학교 공과대학 협동과정 생물화학공학전공, 응용화학부*

Structural Analysis of Thermostable Enzymes

Taejoon Kwon, Young Je Yoo*

Interdisciprinary Course of Biochemical Engineering and Biotechnology, Faculty of Engineering, School of Chemical Engineering*,Seoul National University, Seoul, Korea

서론

효소의 열안정성은 효소 공학에서 가장 중요한 특성 가운데 하나이다. 가장 널리 사용되고 있는 열안정성을 증가시키는 방법으로 고정화나 용매 등을 변형하여 효소의 반응 환경을 조절하는 것이 많이 연구되어 왔지만, 이들 방법은 처리 단계에서 효소의 활성이 크게 떨어지는 단점이 있다. 한편 몇몇의 연구 결과에서는 효소의 유전자 정보를 변형시켜 보다 열안정성이 높은 효소를 개발하고자 하는 연구를 시도하여 왔지만, 유전자 정보와 열안정성 혹은 효소의 특성과의 관계가 명확하지 않은 현재의 시점에서는 정확한 치환 위치를 찾아내기 힘들기 때문에 몇몇 결과를 제외하고는 사용에 많은 제약을 가지고 있다[13]. 최근에는 3차 구조의 정보나 생물리학적 지식, 그리고 발달된 컴퓨터 기술을 이용하여 단백질을 처음부터 설계, 열안정성을 얻고자 하는 시도도 되고 있고 어느 정도 성과도 있지만, 아직까지 모든 단백질에 대해 효과를 볼 수 있는 단계는 아니다[4,10]. 또한 최근 각광받고 있는 인공 진화(directed evolution)은 가장 적은 정보를 가지고도 가장 효과적으로 열안정성 높은 효소를 찾아낼 수 있다는 점이 매력적이지만, 다른 효소의 특성에 비하여 열안정성 부분에 대해서는 숙주(host)의 열안정성이 문제가 되어 그리 효과적이지 못하다[1,9].

1960년대 이후 온천 지대와 같은 고온의 환경에서 살아가는 미생물들이 발견되면서 그러한 생명체를 구성하는 단백질은 높은 온도에서도 활성을 유지한다는 사실이 알려지게 되었다. 따라서 이들 생명체에서 필요한 단백질을 얻어서 생물 공학 분야에 이용하고자 하는 연구와 함께 이들 단백질이 이전에 알려진 단백질들과의 차이를 규명하고자 하는 연구가 많이 이루어져 왔다[14]. 하지만 기존의 연구 방식은 열안정성과 구조의 관계를 넓은 범위의 효소에 대하여 밝히는 방식 보다는 하나의 특정한 효소에 대해서 구조를 고찰하였기 때문에 일반적으로 효소의 열안정성을 고려하는 데에는 많은 제약이 있었다.

본 연구에서는 고온에서 안정성이 있다고 알려진 여러 효소들과, 이와 같은 기능을 수행하지만 상온에서 최적의 반응성을 가지는 효소들을 구조적으로 분석하고 그 내부에 존재하는 비공유 결합들의 관계를 고찰하였다.

이론

효소는 생물 화학 공학에서 사용되는 대표적인 생촉매로 상온 상압에서 특이성 높은 반응을 수행한다는 장점을 가지고 있어 생물 공학 전반에서 다양하게 사용될 수 있기 때문에 오래 전부터 중요한 연구 대상이 되어 왔다[7]. 하지만 단백질로 이루어진 효소는 실제 공정에서 사용될 때 외부의 환경 변화에 지나치게 민감하게 변하여 활성을 쉽게 잃어버릴 수 있다는 단점을 가지고 있다. 그 가운데에서도 온도에 대한 효소의 변성은 실제 공정에서 가장 자주 발생하는 문제이기 때문에 전세계적으로 많은 관심을 받고 있다.  효소의 열안정성이 놓아질 경우 생물화학공정에서 반응 속도의 증가와 공정의 단순화를 통한 경제적 이득, 다른 활성 저해 요소에 대한 안정성 역시 증가하여 보관 역시 용이해 지는 등 많은 이득을 가지고 있다[11]. 하지만 일반적인 효소는 50℃ 이상의 온도만 되어도 아미노산의 가수분해, disulfide bond의 파괴, aggregation 등의 이유로 활성을 잃게 되며, 온도가 높아지면서 분자를 구성하는 원자들의 운동이 활발해지고 그로 인한 자유도 증가로 효소는 활성을 잃게 된다[13].

단백질로 이루어진 효소의 특징을 분자 수준에서 결정하는 것은 바로 효소의 3차 구조이다. 이러한 3차 구조를 이루는 근본적인 원인은 아미노산 사이에 존재하는 비공유 결합력인데[5], 여기에는 대표적으로 소수성 결합과 수소 결합, 이온 결합 등이 포함된다. 일반적으로 생체 내에서 단백질의 3차 구조를 결정하는 가장 큰 원인은 극성이 없는 아미노산 사이에 존재하는 소수성 결합력이라고 알려져 있는데, 50℃ 이상의 고온에서는 소수성 결합이 크게 영향을 미치지 않는다는 것이 밝혀져 있다[5]. 따라서 고온에서 안정한 효소의 경우 이온결합과 수소결합 등 정전기적인 힘에 의하여 구조적 안정성이 유지된다고 받아들여지고 있다[14].

한편 효소의 전체적인 구조를 볼 때에는 효소 내부에 존재하는 빈 공간이 열안정성과 관계가 있다는 점이 알려져 있다. 효소 내부에 아미노산 치환을 통하여 새롭게 공간을 만들어준 경우 열안정성이 떨어지는 점이나, 공간을 채워줄 수 있는 아미노산으로 치환하는 경우 열안정성이 증가한다는 점이 실험적으로 밝혀졌다[8]. 한편 이러한 효소 내부의 공간은 전체적으로 볼 때 효소의 밀집도와도 관계가 있어서 온도에 대한 안정성 뿐만 아니라 다른 효소의 활성을 파괴하는 요소들에 대해서도 안정성을 갖게 한다.

단백질의 3차원 구조를 분석할 때 단백질의 부피와 표면적은 크게 세 가지 개념으로 설명된다. van der Waals 표면은 단백질을 구성하는 각각의 원자들의 van der Waals 표면을 연결하여 정의한 표면을 말한다. 반면 solvent accessible 표면과 molecular surface 는 가상의 구형 용매 분자(보통 물을 기준으로 지름 1.4 Å으로 설정한다)가 단백질의 van der Waals 표면을 지나면서 생기는 궤적으로 정의되는데, 구형 용매 분자의 중심을 기준으로 정의하는 것이 solvent accessible 표면이고, 용매 분자와 van der Waals 표면이 접하는 면을 기준으로 정의하는 것이 molecular surface 이다. 1970년대 후반과 1980년대 초반 이러한 개념이 정의되었을 때에는 이 계산을 위하여 수치 해석적인 방법을 이용하였는데, 최근에는 보다 정확한 결과를 빠르게 얻을 수 있는 계산법이 다양하게 개발되고 있다. 그 가운데 alpha shape theory는 weighted Volonoy decomposition 과 alpha complex 의 이중성을 이용하는 방법이다[6].

열안정성이 높은 고온안정 효소가 발견된 이후 그 구조 정보가 밝혀지면서 일반 효소와의 구조적 특징을 밝히려는 시도가 다양하게 이루어졌다. 가장 초기에 시도된 방법은 아미노산의 서열을 비교하는 방법이었는데, 이 방법으로 몇 가지 특징을 발견할 수 있었지만, 타당한 논리로 설명하기에는 부족함이 있다. 따라서 이후 3차 구조의 정보를 가지고 그 안에서 다양한 결합력과 3차원적 특징을 분석하기 시작했는데, 대부분의 3차 구조를 결정하는 방식인 단백질 결정을 X-ray로 분석하는 방법으로는 단백질 내부의 수소 원자 위치를 정확하게 판단할 수 없기 때문에 수소 결합이나 이온 결합과 같은 비공유 결합을 판단하는 데 그 기준을 어떻게 정하는가에 따라서 결과의 차이를 보이는 등 문제점을 가지고 있다. 가장 일반적으로 비공유 결합을 판단하는 기준은 가능한 원자들 사이의 거리를 기준으로 판단하는 것인데, 일반 단백질의 경우 4Å 정도의 거리에서 수소 결합 및 이온 결합이 형성된다는 사실이 통계적으로 알려져 있다[2,3].

대상 및 분석 방법

1. 열안정 효소 선정

모든 효소의 3차 구조 정보는 Protein Data Bank(PDB ; http://www.rcsb.org/pdb) 에서 구했다. 우선 □thermophilic', 'hyperthermophilic', 'thermostable', 'Pyrococcus', 'Thermus', 'Thermotoga', 'Thermophilus' 와 같은 주제어 검색을 통하여 열안정 효소의 구조 정보를 얻고, 이를 바탕으로 같은 기능을 하는 일반 효소(열안정성이 낮은 효소)의 구조 정보를 얻었다. 여러 개의 일반 효소 구조 정보가 존재하는 경우에는 다음과 같은 기준을 가지고 그 가운데 하나의 효소 구조를 선택하였다.

·보다 정확한 구조 (X-ray 자료의 경우 보다 높은 resolution)

·단백질 이외의 물질이 적게 포함된 구조 (기질, 물분자 등)

·먼저 구한 열안정 효소와 구조적으로 보다 유사한 구조

이런 방식으로 다음과 같은 7개의 효소에 대하여 열안정성이 각기 다른 효소의 구조 정보를 얻었다.

(1) Glutamate dehydrogenase (GDH ; EC 1.4.1.-)

(2) D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH ; EC 1.2.1.12)

(3) Phosphoglyceraldehyde kinase (PGK ; EC 2.7.2.3)

(4) Methionine aminopeptidase (MAP ; EC 3.4.11.18)

(5) Inorganic pyrophosphatase (PPASE ; EC 3.6.1.1)

(6) Ribonuclease H/HⅠ (RNH ; EC 3.1.26.4)

(7) Citrate synthase (CS ; EC 4.1.3.7)

또한 인공 진화(directed evolution) 방법으로 열안정성을 증가시킨 p-Nitrobenzyl esterase(pNBE)의 구조를 같이 비교하였다.

2. 계산 방법

효소 내부의 빈 공간과 전체 넓이와 부피의 계산, 그리고 아미노산의 위치를 정의하기 위한 표면 계산에는 NCSA에서 개발한 alpha-4.1 프로그램을 사용하였다. Solvent accessible surface 계산에서 용매는 지름 1.4Å인 구형으로 정의하여 계산했으며, 효소의 밀집도(compactness)를 단위 부피당 표면적으로 정의하여 비교했다.

이온결합은 LYS, ARG, HIS의 질소 원자와 ASP, GLU의 산소 원자가 4Å 이하의 거리에 존재하는 경우에 형성된 것으로 고려하였으며, 수소 결합 역시 거리 기준을 같이 하고 수소 결합을 형성할 수 있는 CYS, HIS, LYS, ASN, GLN, ARG, SER, THR, TYR, TRP, ASP, GLU, MET 아미노산을 고려하였다.

결과 및 토론

분석은 크게 효소 내부의 빈 공간 크기, 효소의 밀집도, 이온 결합의 수와 수소 결합의 수를 비교하였다. 효소 내부의 빈 공간 크기와 효소의 밀집도는 solvent accessible 표면과 molecular surface 두 종류에 대하여 비교하였고, 이온 결합과 수소 결합의 수는 그 결합에 참여하는 아미노산의 위치(빈 공간, 효소 표면, 혹은 그 이외)에 따라 나누어 분석하였다. 분석 결과 효소의 밀집도와 효소 내부의 빈 공간 크기가 열안정성과 보다 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 또한 solvent accessible 표면보다는 molecular surface 가 보다 확연한 비교 결과를 보여주었다.

표  효소의 밀집도 비교

	GDH	GAPDH	PGK	MAP	PPASE	RNH	CS	pNBE
mesophilic	0.3252	0.2432	0.4474	0.3318	0.3548	0.3932	0.3467	0.3272
thermophilic	0.3045	0.2411 0.2391 0.2364	0.3166 0.3176	0.3253 0.3097	0.3600	0.3687	0.2700	0.3211 0.3168

표  효소 내부의 빈공간 크기 (Å3)

	GDH	GAPDH	PGK	MAP	PPASE	RNH	CS	pNBE
mesophilic	694.9	312.2	1922.5	788.9	106.8	79.3	715.6	1130.3
thermophilic	531.2	334.7 279.0 425.8	321.7 266.0	174.1 98.6	80.9	207.4	1063.2	910.3 1145.7

이온 결합과 수소 결합의 분석 결과는 위의 밀집도나 빈공간 크기 이온 결합의 크기보다 경향성이 적게 나타났다. 하지만 그 가운데에서도 효소 표면에 존재하는 이온 결합의 수가 열안정성이 높을수록 증가하는 것을 볼 수 있었는데, 이는 효소 표면에 존재하는 아미노산 사이의 이온 결합을 통하여 효소의 유동성이 감소한다는 것과 효소들 사이의 결합을 통한 안정화 가능성을 보여주는 것이다.

참고문헌

1. Arnold FH, Chem. Eng. Sci., 52(34), 5091 (1996)

2. Baker EN, Hubbard RE, Prog. Biophys. Molec. Biol., 44, 97 (1984)

3. Barlow DJ, Thornton JM, J. Mol. Biol., 168, 867 (1983)

4. Dahiyat BI, Curr. Optin. Biotech., 10, 387 (1999)

5. Dill KA, Biochemistry, 29(31), 7133 (1990)

6. Edelsbrunner H, Facello M, Fu P, Liang J, Proc. 28th Ann. Hawaii Internat. Conf. System Science, 5, 256 (1995)

7. Joo, H, Yoo, Y.J., Dordick, J., Kor.J.Chem.Eng., 15, 362 (1998)

8, Karpusas M, Basse WA, Matsumura M, Matthews BW, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8237 (1989)

9. Kuchner O, Arnold FH, Trends Biotech., 15, 523 (1997)

10. Malakauskas SM, Mayo SL, Nature Struct. Biol., 15(6), 470 (1998)

11. Mozhaev VV, Trends Biotech., 11, 88 (1993)

12. van den Berg B, Vriend G, Veltman OR, Venema G, Eijsink VGH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2056 (1998)

13. Vihinen M, Prot. Eng., 1987, 1(6), 477 (1987)

14. Vogt G, Woell S, Argos P, J. Mol. Biol., 269, 631 (1997)