초임계 유체를 이용한 Peptide의 효소합성

김 승 현, 윤 성 화, 김 철

아주 대학교 화학·생물공학부

Enzymatic synthesis of Peptide by using Supercritical Fluids

Seung Hyoun Kim, Sung Hwa Yoon, Chul Kim

Division of Chemical Engineering and Biotechnology, Ajou University

서 론

생물공학에 관심을 갖게된 이래로 일련의 유기 용매계들이 비수용성 효소반응에서 사용되어 왔으며, 특별히 물과 혼화할 수 있는 유기 용매에서의 효소반응들이 비극성 용매에서 거의 잘 녹지 않는 다양한 기질(amino acid 등) 용해도에서   이점이 있음을 밝혀내었다. 본 실험에서는 소량의 water를 함유한 Supercritical carbon dioxide/acetonitrile 용매계로 N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester (Ac-Tyr-OEt·H2O)와 glycinamide (H-Gly-NH2·HCl)로부터 □-chymotrypsin을 효소로 사용한  N-acetyl-L-tyrosylglycinamide(Ac-Tyr-Gly-NH2) 합성을 실행하였다. 위 실험에서 최적의 water 함유량이 peptide 합성시 중요한 역할을 하였으며, 실험은 batch reactor system을 사용하였고 일정시간 동안 각각의 압력조건 하에서 항온처리하여 합성된 peptide를 얻었다.

본 실험에서 초임계 유체로 사용된 CO2는 기존의 전통적인 액체 용매와 비교하여 무독성이며 분리가 용이하고 값이 싼 장점이 있으며, 낮은 점도, 높은 물질 전달과 확산성을 가지므로 일반적인 초임계 유체로 주로 사용된다. 또한 낮은  임계온도(31.5℃), 낮은 임계압력(72.8bar)의 특성 때문에 열에 불안정한 식품이나 제약분야에 적용하기가 용이하다.

사용된 chymotrypsin은 유기 용매에 잘 용해되며 합성을 위한 유효한 촉매로서, 이를 사용시 amino acid esters에 또다른 amino acid나 peptide를 붙여 다양한 polypeptide를 생산해낼 수 있는 장점이 있다

실 험

1. 시약 및 장치

특별한 단백질 가수분해 효소 활성도(proteinase activity)를  갖는 bovine pancreatic □-chymotrypsin(CT) (EC 3.4.21.1)을 Sigma Chemical Co.로부터  구입하였다. 또한, N-acetyl-L-tyrosylglycinamide (Ac-Tyr-Gly-NH2·HCl), N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester(Ac-Tyr-OEt·H2O), glycinamide hydrochloride (H-Gly-NH2·HCl)는 Advenced ChemTech.로부터 구입하였다. Guaranteed reagent 등급의 acetonitrile과 triethylamine(Et3N)은 더 이상의 정제 없이 사용하였다.

실험장치는 Figure 1에 나타낸 바와 같이 이산화탄소 주입부, batch reactor, 항온조, 그리고 시료 채취부로 구성되어 있다. Reactor에 공급되는 이산화탄소의 압력은 back-pressure regulator로 ±1% 범위로 조절하였고, reactor의 반응   온도는 순환 가열기가 부착된 항온조 내에서 thermocouple로 온도를 측정하여 오차범위 ±0.5℃ 내에서 조절하였다. Reactor는 내부 부피가 300□인 High pressure reactor를 사용하였다.

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②     ③        ④                                  ⑪

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①                                  ⑤

⑬

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Fig. 1 Schematic Diagram of Batch System

① CO2 bomb ③ Pump ⑤ Reactor ⑦ Pressure gague ⑨ Water bath ⑪ Sampling valve (double) ⑬ Back pressure regulator ⑮ Purge valve	② Cooler ④ Input valve (double) ⑥ Magnetic bar ⑧ Thermocouple ⑩ Digital stirring bath ⑫ Sample receiver ⑭ Pressure gauge

2. 실험 방법

Substrate인 Ac-Tyr-OEt·H2O과 Gly-NH2·HCl 시료 일정량을 취하고 이를 활성화하기 위한 chymotrypsin과 triethylamine, water를 acetonitrile과 함께 reactor에 주입한다. 항온조의 온도를 일정온도로 유지한 후, pump를 사용하여 이산화탄소를 reactor 안에 주입한다. System을 폐쇄하고 back-pressure regulator로 이산화탄소를 배기하면서 압력을 조절한다. 온도와 압력이 설정값에 도달하면 반응 시간을 측정하기 시작한다. 일정 시간이 경과한 후 시료를 채취하여 전개 용액에 적당히 희석하여 HPLC를 이용하여 분석한다.

3. 분석 방법

시료를 Polytetrafluoroethylene membrane filter로 정제한 다음, Water 510 HPLC pump, UV detector를 이용하여 분석하였고, column은 Shiseido Capcell-Pak C18 column(150□×4.6□□)을 사용하였다. 전개 용매로는 water/acetonitrile (4:1 by vol.)을 사용하였고, flow rate는 1□/min으로 하였으며, UV 흡광도 220□에서 측정하였다.

결과 및 토론

5시간동안 상온·상압하에서 acetonitrile만을 용매로 사용하였을 때의 peptide 합성 수율은 겨우 65% 내외였으나, 초임계 이산화탄소를 acetonitrile과 일정비율 혼합하여 사용하면 그 수율이 90% 이상으로 증가하였다. 또한 초임계 이산화탄소/acetonitrile 용매계에서 압력에 따라 합성 수율이 변화함을 알 수 있었고, 첨가된 water 양의 변화에 의해서도 달라짐을 알 수 있었다. 따라서 가능한 여러 가지 parameter를 조절하여 적절한 반응 환경을 찾아내, 최대의 peptide 합성 수율을 얻을 수 있는 최적조건 연구가 수행되어야겠다.

또한 합성된 peptide에 계속해서 amino acid를 결합시킴으로써 dipeptide, tripeptide 혹은 그 이상의 다양한 polypeptide를 합성해 나가는 연구가 점차 수행되었으면 한다.

참고 문헌

1. Kise, H., Hayakawa, A., and Noritomi, H. (1990). J. Biotechnol., 14, 239.

2. Fogler, H. S. (1992). Elements of Chemical Reaction Engineering,

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3. Noritomi, H., Miyata, M., Kato, S. (1995). Biotechnology Letters, 17, 12.

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6. McHugh, M. A. and Krukonis, V. J. (1986). Supercritical Fluid Extraction,

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7. Noritomi, H. and Kise, H. (1987). Biotechnology Letters, 9(6), 383.

8. Sergeeva, M. V., Paradkar, V. M., Dordick, J. S., (1997).

Enzyme & Microbial Technology, 20, 623

Fig. 1 Effect of SC-CO2 on peptide synthesis by using supercritical carbon dioxide/acetonitrile system		Fig. 2 Effect of water content on peptide synthesis by using supercritical carbon dioxide/acetonitrile system