유기산 및 포도당 기질의 공급이 Azotobacter vinelandii UWD

균주의 생장에 미치는 영향 연구

김태용, 박찬엘, 유형덕, 박창호*

경희대학교 환경·응용화학부, 경희대학교 산학협력기술연구원*

Effect of Organic Acids and Glucose Substrates

on the Growth of Azotobacter vinelandii UWD

Taeyong Kim, Chanel Park, Hyungduk Yoo and Chang-Ho Park*

Dept. of Chemical Eng. and Industrial Liaison Research Institute* of Kyunghee Univ.

서론

기존의 플라스틱은 폐기과정에서 다량의 오염물질을 배출하고, 자연생태계에서 분해되는데 오랜 시일이 걸려 많은 환경오염 문제를 일으키고 있다. 이러한 단점을 보완한 것으로 분해가 용이한 고분자 물질이 새롭게 부각되고 있으며 그 중 poly-hydroxyalkanoates (PHA)는 Alcaligenes eutrophus에 의해 생산되는 미생물 유래 생분해성 고분자로 많은 연구가 진행되고 있다.1)

PHA는 자연계에서 Alcaligenes eutrophus와 methylotroph 같은 미생물에 의해  N, P, S, Mg, K 등 일부 영양소 제한 상태에서 생성되는 것으로 생분해성(Biode- gradability) 및 생체적합성 (Biocompatibility)을 갖는 물질이다.1,2). PHA 중 가장 잘 알려진 예가 polyhydroxybutyrate (PHB) 와 Poly(3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate) (PHBV)이다.3)

한편 Azoteobacter vinelandii UWD 균주는 유전공학적으로 변형되어 특정 영양소 제한을 가하지 않고도 PHA보다 물성이 뛰어난 PHBV를 생산한다.4) PHB는 포도당등 탄소수가 짝수인 기질만을 사용하였을 때 만들어지지만 PHBV는 propionic acid와 같은 홀수의 탄소수를 가진 기질이 첨가되어야 생산될 수 있다.5,6) PHBV는 물성과 가공성이 보통의 난분해성 플라스틱만큼 우수하나 생산단가가 높기 때문에 아직 보편적으로 사용되지 못하고 있다. 이러한 PHBV는 홀수의 탄소원 기질을 공급해야 생산이 가능하므로 본 연구에서는 각종 유기산을 농도별로 배지 중에 첨가하였다. 그리고 이들 홀수 탄소원으로 이용되는 유기산을 배양 초기에 첨가하여 배양함으로서 일정 시간 후 포도당과 같은 주탄소원을 추가로 첨가하였을 때 PHBV가 효과적으로 생산 가능하다. 또한 이들 유기산을 사용하여 초기 균주생장에 유리한 농도조건을 탐색하였다.

재료 및 방법

본 실험에 사용된 균주는 Azoteobacter vinelandii UWD(ATCC 53799)로 ATCC에서 동결건조 상태로 구입하였다. 배지는 기본적으로 Burk 배지를 이용하지만 A. vinelandii UWD에 적합하도록 변형된 Burk 배지7)를 사용한다. 주요 구성성분은 KH2PO4 (0.2 g/L), K2HPO4 (0.8 g/L), MgSO4·7H2O (0.2 g/L), CaSO4·2H2O(0.1 g/L), FeCl3(미량), Na2MoO4(미량), 그리고 탄소원으로써 glucose 및 유기산을 연구의 목적에 부합하도록 첨가한다. 균주의 배양과 보존을 위해 glucose 배지를 사용하여 pH 7.3,  30℃ 조건에서 계대 배양하였으며 균주는 30℃조건에서 배양시키고 4℃에서 냉장보관하며 유지시켰다. 실험 배지중에 첨가한 유기산은 acetic acid, propionic acid, valeric acid로 사용 농도범위는 각각 1∼5g/L, 0.5∼3g/L, 0.2∼3g/L 이었다. 유기산을 첨가한 후의 균주생장은 진탕배양기를 이용하여 실험하였다. 한편, 실험에 사용한 접종배양액은 진탕배양기를 이용하여 16∼18시간 동안 250rpm, 30℃에서 미리 배양하여 준비하였다. 그런 다음 접종액 4ml을 취하여 각각의 유기산 또는 이들 유기산이 일정비율로 혼합되어 첨가된 배지에 접종하였다. 실험은 배지 80ml이 담긴 250ml 삼각 플라스크에서 18∼24시간 동안 생장시키며 진행되었다. 생장조건은 250rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하며 일정시간 간격으로 시료 채취하였다. 시료는 spectrophotometer를 이용하여 620nm 조건에서 O.D.를 측정하였고, O.D. 수치와 시간을 표시한 semilog 표를 이용하여 대수성장기에서의 비생장속도를 측정하였다.

결과 및 고찰

많은 미생물의 경우 유기산은 포도당에 비하여 선호도가 떨어지는 기질이다.8) 유기산의 농도가 너무 높거나 낮은 경우 세포생장이 저해된다9). 본 연구에 이용된 유기산의 농도는 표 1과 같다. 그리고 세포의 증식과 PHA 합성은 동시에 일어나므로10) 측정된 O.D.를 대수성장기의 비생장속도로 환산한 결과 acetic acid는 3.0g/L일 때 0.33hr-1, propionic acid는 1.0∼1.5g/L일 때 0.183hr-1 그리고 valeric acid는 1.0g/L일 때 0.137hr-1로 가장 높은 비생장속도를 나타냈다(Figure 1).

Propionic acid를 농도별로 배지에 첨가하여 균주의 생장을 관찰하였다(Figure 2). Propionic acid의 경우 1.5∼3.0g/L을 첨가한 배지에서의 균주 생장은 비슷한 양상을 나타내었으나 농도가 0.5∼1.0g/L인 경우는 약 15시간 배양 후 거의 일정하게 세포 농도가 유지되었다. 이것은 탄소원으로서의 propionic acid가 glucose나 acetic acid에 비하여 균주가 이용하기에 유리하지 않으며 또한 배양 초기부터 농도가 낮아서 나타난 현상이라 생각된다.

균주 생장에 있어서 valeric acid는 5가 탄소원이므로 3가 탄소원인 propionic acid 보다 불리하여 비생장속도가 낮게 나오리라는 예상과 일치하였다. 그리고 propionic acid와 valeric acid 각각의 최고 비생장속도를 나타내는 유기산 농도를 50:50 비율-propionic acid: 0.75g/L와 valeric acid: 0.5g/L-로 혼합하여 실험한 결과 생장속도는 0.196hr-1 이었다.

포도당을 농도별로 배지에 첨가하여 균주의 생장을 관찰한 결과 glucose 농도가 20g/L일 때 그 이외의 농도에 비해 생장이 비교적 우수하였다(Figure 3). 그러나 glucose 농도를 높인 배지에서는 균주의 생장이 저조하였는데, 이것은 유기산의 경우처럼 기질이 고농도로 공급되었을 때 균주생장이 저해되었음을 의미한다.

이러한 결과는 소규모 pilot 규모의 생물반응기 조업시 포도당과 같은 탄소원을 추가로 첨가했을 때 효과적으로 PHBV를 생산하기 위한 사전 기초자료로 이용될 수 있다.

표 1. 유기산의 농도

구 분	농도 범위(g/L)
Acetic acid	1.0∼5.0
Propionic acid	0.5∼3.0
Valeric acid	0.2∼3.0

표 2. 유기산 혼합물을 첨가했을 때의 비생장속도

구 분	농 도(g/L)	비생장속도(hr-1)
Propionic acid	1.0∼1.5	0.183
Valeric acid	1.0	0.137
Mixture (propionic acid + valeric acid)	0.75+0.5	0.196

Figure 1. 유기산 종류와 농도에 따른 비생장속도

Figure 2 Propionic acid 농도 및 유기산 혼합물 농도에 따른 생장곡선

Figure 3 Glucose 농도별 생장곡선

참고문헌

1. Doi, Y., "Micobial Polyesters", VCH publishers, New York(1990)

2. A. steinbuchel and H. G, Schlegel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 168(1989)

3. Wallen, L. L. and W. K., Environ. Sci. Technol., 8, 576(1974)

4. Cho, K.-S., H. W. Ryu, C.-H. Park, and P. R. Goodrich, Biotechnol. Lett., 19, 7 (1997)

5. Page, W. J., Appl. Microbial. Biotechnol., 31, 329(1989)

6. Page, W. J., J. Manchak, and B. Rudy, Appl. Microbial. Biotechnol., 58, 2866(1992)

7. Page, W. J., and O. Knosp, Applied and Environment Microbiology, 55, 1334 (1989)

8. Gettschalk, G., "Bacterial Metabolism", 2nd ed., Springer-Verlag, New York(1985)

9. Qian L., M. S. Thesis, The University of Minnesota, USA(1995)

10. 조경숙, 류희욱, 박창호, 대한환경공학회지, 18, 1259(1996)