Saccharomyces cerevisiae를 이용한 ceramide(Ⅲ)의  HPLC 분리

(Ⅱ) ELSD를 이용한 분석

여미순 · 강덕희 · 정용안· 김세경↗· 윤현식↗· 노경호

초정밀분리기술센터, 인하대학교 화학공학과,↗생물공학과

HPLC Separation of Ceramide(Ⅲ) by Saccharomyces cerevisiae

(Ⅱ) Analysis by ELSD

Mi Soon Yeo · Duk Hui Kang · Yong An Jung ·

Se Kyung Kim↗·Hyun Shik Yun↗·Kyung Ho Row

Center for Advanced Biosepration Technology, Dept. of Chem. Eng., ↗Dept. of Bio. Eng., Inha University,

Inchon 402-751, Korea

서론

우리 몸에서 피부보호기능을 하는 각질층의 세포간 지질 조성물은 ceramide 40%, 콜레스테롤이 25%, 지방산이 25%, 콜레스테롤 솔베이트가 10%로 구성된다. Ceramide는 각질층의 수분의 손실방지와 손상된 피부 보호층을 복원하는 중요한 성분으로 알려져 있다. 두겹의 캡슐형상으로 되어있는 ceramide는 그 내부에 포함되어 있는 수분과 영양분을 빠른 속도로 목적지에 운반해 가는 성질이 있으며, 그 침투성도 다른 성분과 비교할 수 없을 만큼 뛰어나다고 알려져 있다.[1] ceramide 생산은 주로 동물성 원료에서 연구되고 있는데 얼마전의 광우병 파동등의 영향으로 현재는 식물성 원료로 대처해 나가고 있다. 최근에는 yeast에서 생산하는 sphingolipids에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.[2] Yeast는 상대적으로 빠른 성장, 비유독성 그리고 발생적으로 조종될 수 있는 능력때문에 ceramide의 생산을 위해 적합한 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, yeast에 의한 ceramide의 생산 그리고 그 양에 대한 정량적인 실험결과는 아직 확실히 알려진 것이 없다. 현재까지 생산되는 ceramide는 단지 두 종류의 yeast, Saccharomyces cerevisiae와 Torulopsis(Candida) utilis에서만 발견되고 있다.[1]

Yeast에 의한 ceramide의 생산 그리고 그 양에 대한 정량적인 실험결과를 얻기 위해서 정상 HPLC를 이용하여 실험하였다. Yeast ceramide는 배양조건에 따라서 구조가 변한다. 빠르고 정확한 지질의 구성을 알기 위해서 정상 HPLC-ELSD를 사용한 연구가 진행중이다.[3] ELSD는 HPLC- UV보다 ceramide 분석에 더 적합한 것으로 알려져 있다.[4] 본 연구에서는 Ceramide의 원물질인 sphingolipid를 생산하는 yeast의 한 종류인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고 정상 HPLC와 ELSD를 사용하여 생산량과 순도를 더욱 높게 하는 것이 연구의 목적이다.

실험 방법

1. 균주 및 배양

본 연구에서 사용한 균주는 sphingolipid를 생성하는 것으로 알려진 Saccharomyces cerevisiae (KCCM 50515)이다. 균주의 활성을 유지하기 위하여 두 주일 단위로 평판배지에 계대배양한 후 4℃ 냉장고에서 보관하면서 접종용 균주 배양에 사용하였다. 균주 배양을 위한 배지는 YEPD medium으로 그 조성은 glucose, 20g/L; bacto peptone, 20g/L; yeast extract, 10g/L 이었다. 배양 조건은 250mL erlenmeyer flask내에 배지 50mL를 주입, 접종한 후 회전식 진탕 배양기를 사용하여 배양 실험을 수행하였다. 작동 온도는 30℃, 회전수는 200rpm이었으며 배양 시간은 48시간이었다.

2. Lipid 회수

생성된 lipid는 원심분리 방법과 ultrasonification 방법을 이용하여 추출하였다. Saccharomyces cerevisiae를 배양한 후, 회수한 배양액을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지성분을 제거하고, 증류수로 두 번 washing하여 균체만 채취하였다.

3. Lipid 추출

5g(wetweight)의 yeast균체에 20mL chloroform - methanol (1:2, v/v) 용액을 첨가한 후 sonicator(IKA U200S)로 5분씩 세 번 sonication 하였다. sonication한 샘플은 0.2□ RC filter(Sartorius)로 filtering 하였다. 여과되지 않고 남은 균체는 다시 50mL의 chloroform-methanol(2:1, v/v) 용액을 첨가하여 상온에서 30분동안 stirring 한 후 다시 filtering 하는 과정을 4번 반복하였다. 회수된 샘플용액은 solvent evaporation 하여 건조하였다.

4. Ceramide의 분리, 정제

건조된 total lipid는 sphingolipid를 획득하기 위해 mild alkaline hydrolysis 방법을 수행하였다. 건조된 lipid sample을 methanol - carbon

tetrachloride(5:1, v/v) 용액에 녹인 후 0.2M의 methanolic NaOH를 동량 첨가하여 상온에서 한시간 동안 alkaline hydrolysis를 하였다. 그 후 0.8배의 증류수를 첨가하여 교반한 후 1M의 acetic acid로 중화시켰다. unsaponified lipid를 chloroform으로 추출하였다.

5. 정상 HPLC-ELSD

HPLC 시스템으로는 Waters 600s Multisolvent Delivery System이 부착된 Waters 616 liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U.S.A.), 그리고 Rheodyne injector (20□ sample loop)이 사용되었다. 데이터 수집은 Millennium 32 (V. 3.05, Waters, U.S.A)가 PC에 install 되었다. ELSD (Alltech)의 drift temperature는 65℃이며, N2 flow rate는 1.6 l/min이였다. 이동상으로는 클로로포름, 그리고 메탄올이 사용되었다. HPLC용 column(Licroprep Si 60 15□, 3.9×150mm)은 진공 펌프를 이용하여 채웠다. 이동상의 유속은 1.0ml/min으로 고정되었다.

결과 및 고찰

Ceramide의 원물질인 sphingolipid를 생산하는 yeast의 한 종류인 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고 제조용 정상 HPLC를 사용하여 ceramide의 존재여부를 이전 연구에서는 UV detecter를 사용하였고[5] 본 연구에서는 ELSD를 사용하였다. 셀 배양후의 추출물은 불순물이 많이 포함되어 있으므로, ACRODISC CR PTFE 0.45□를 이용하여 필터를 하였다. 배양 추출액의 농도를 증가시키기 위해서 Rotary evaporator를 이용하여 셀 배양물 약 150ml를 2ml로 농축하였다. 셀 배양 조건에 따른 ceramide의 양을 알아보기 위하여 온도와 pH에 따라서 배양했다. 정상 HPLC의 분석에서 첨가제 메탄올의 조성은 분석을 시작할 때에 10 vol.%에서 3분까지 70 vol.%으로 변화시키면서 각각의 단계에서 선형적인 변화를 주었다. Ceramide의 온도 변화는 25, 30, 35, 40℃로 하였고, 그 중 30℃에서 ceramide의 양이 가장 많았다(Fig1). pH는 4, 5, 6, 7, 8 이고 온도는 30℃이다. 이 중 pH 4에서 가장 많이 결합되었다(Fig2). 이 결과로 피크의 면적을 비교함으로써 셀 배양후의 추출액에는 약 3%(면적기준)의 ceramide가 존재함을 알 수 있었다.

알림

본 연구는 초정밀분리 기술 센터의 연구비지원에 의해서 수행되었습니다.

참고문헌

1. Rupeic, J., Mesaric, M., and Maric, V., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 583 (1998)

2. Dickson, R. C., and Lester, R. L., Biochimica et Biophysica Acta., 1426, 347 (1999)

3. Norlen, L., Nicander, I., Lundsjo, A., Cronholm, T. and Forslind, B., Arch Dermatol. Res., 290, 508 (1998)

4. Zhou, J. Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., and Baillet, A.,       J. Chromatogr. A 859, 99 (1999)

5. Kim, S., K., Kang, D., H., Yun, H., S., and Row, K., H., Theories         and Appl. Chem. Eng., 7, 773 (2001)

Fig. 1 Chromatogram of cultured cell extraction solution of 30℃ uncontrolled pH using NP-HPLC with ELSD eluted in gradient method

Fig. 2 Chromatogram of cultured cell extraction solution of pH 4 at temperature 30℃ using NP-HPLC with ELSD eluted in gradient method