곤충병원성 선충으로부터 분리된 장내박테리아의 성장특성 및 살충성

유연수*, 박선호*, **

(주)바이코시스 부설연구소*, 계명대학교 공학부**

Culture Characteristics and Insecticidal Activity of

Enterobacteriaceae Isolated from Entomopathogenic Nematodes

Yeon Su Yu*, Sun Ho Park*, **

Biotechnology Research Institute, Advanced Biocontrol System Co., Ltd.*

Faculty of Engineering, Keimyung University**

서론

Steinernematidae와 Heterorhabditidae속 곤충병원성 선충(entomopathogenic nematodes)은 해충의 입, 항문, 기문과 같은 자연개구를 통해 해충 혈장(hemolymph)에 침투한 후 장내 공생박테리아를 분비한다(1). 분비된 공생박테리아는 살충물질을 생성하여 24-48시간 내에 해충을 사멸시키고 선충 증식에 필요한 필수 영양소를 제공하며 공생관계를 유지한다(2-3). 곤충병원성 선충으로부터 분리한 공생박테리아 Xenorhabdus 혹은 Photorhabdus속은 endotoxin은 물론 강력한 exotoxin을 생산하는 것으로 알려져 있다(4). 공생박테리아가 생성하는 exotoxin에 관한 연구로는 Heterorhabditidae의 공생박테리아인 Photorhabdus luminescens의 배양여액으로부터 분자량이 100,000 이상인 살충단백질이 분리되었으며, 이 물질은 나노 그람의 양으로도 면역성이 강한 tobacco horn worm, Manduca sexta 유충을 사멸시킬 수 있는 것으로 보고되었다(5). 반면 공생박테리아의 endotoxin은 해충사멸의 직접적인 원인이 되기보다는 공생박테리아가 해충의 면역체계에 의해서 파괴되는 것을 방지함으로서 해충 내부에서 공생박테리아가 생존 및 번식하여 exotoxin을 생산할 수 있도록 도와준다(6). 또한 최근 곤충병원성 선충으로부터 분리한 공생박테리아를 단독으로 파밤나방(Spodoptera exigua) 혹은 흰나비(Pieris brassicae) 등의 유충에 접촉한 경우 우수한 살충효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(7). 최근 국내에서도 토착성 곤충병원성 선충 Steinernematidae 6종과 Heterorhabditidae 1종에 대한 장내 공생박테리아가 분리되었다(8-12).

본 연구에서는 곤충병원성 선충으로부터 분리된 여러종의 공생박테리아를 이용하여 그 성장특성 및 배양시간에 따른 분비물질의 살충성과 해충에 대한 구강독성을 비교, 조사하였다.

실험재료 및 방법

공생박테리아의 배양시간에 따른 살충성 정도를 조사하기 위해서 S. glaseri NC로부터 분리한 공생박테리아 XR-NC를 대상으로 modified YS(5YS; 5% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.05% K2HPO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O)배지를 이용하여 배양을 실시하였다. 배양은 250 mL flask에서 working volume을 100 mL로 28℃, 200 rpm 조건으로 약 5일간 배양하면서 24시간 간격으로 배양액을 채취하고 O.D.를 측정하였다. 또한 균주가 포함된 배양액과 상등액을 각각 microsyringe를 이용하여 꿀벌부채명나방 유충에 3 □L씩 접종하여 살충성을 조사하였다. 그리고 각각 분리된 수종의 공생박테리아 살충성을 비교하기 위해서 5YS배지를 이용하여 250 mL flask에서 36시간 배양한 다음 각각의 공생박테리아 배양액과 상등액을 꿀벌부채명나방 유충에 접종하여 살충성을 조사하였다.

공생박테리아의 꿀벌부채명나방 유충에 대한 구강독성(oral toxicity)을 조사하기 위해서 공생박테리아 XR-NC와 S. carpocapsae PC로부터 분리한 공생박테리아 XR-PC를 사용하였다. 공기가 통하는 petri dish(90×25 mm)에 쌀겨와 밀을 주성분으로 사용하는 유충사료 20 g을 채웠다. 공생박테리아 접종농도의 영향을 조사하기 위해서 5YS배지에서 배양한 공생박테리아 배양액을 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전한 pellet을 원액, ×5, ×10으로 희석하여 1 mL이 되게 하였다. 그리고 각각의 petri dish에 공생박테리아 pellet을 넣고 유충사료 20 g과 섞은 후 체중이 약 63±3 mg 정도인 2령 단계의 꿀벌부채명나방 유충을 각각의 petri dish당 10마리씩 접종하고 25℃ incubator에서 증식하면서 유충의 체중변화와 유충의 다음 단계인 번데기, 나방으로의 생활사 변화 및 사멸율을 함께 조사하였다.

결과 및 토의

Fig. 1은 XR-PC를 5YS배지에서 배양하면서 매일 배양액을 채취하여 원심분리한 상등액을 microsyringe를 이용하여 꿀벌부채명나방 유충의 hemolymph에 주사하였을 때 유충사멸속도를 조사하여 배양시간에 따른 상등액의 살충성 정도를 조사한 것이다. 상등액을 원액, ×2, ×4, ×8로 희석하여 접종한 결과 배양 1일째인 O.D. 약 0.1에서 살충성이 가장 강하게 나타났으며 배양시간이 경과함에 따라서 살충성은 조금씩 감소되었다. 즉 XR-PC의 경우 지수성장기 초기에 살충성이 가장 강하게 나타났으며 배양이 더 진행됨에 따라서 감소하였다.

Table 1은 5종류의 공생박테리아를 5YS배지에서 36시간 flask로 배양한 다음 각각의 배양액과 상등액을 꿀벌부채명나방 유충을 이용하여 살충성을 조사한 것이다. XR-DR은 O.D. 0.254, XR-NC는 O.D. 0.287, XR-MK는 O.D. 0.207, XR-PC는 O.D. 0.290, XR-CR은 O.D. 0.208까지 증식되었으며, 이때 각각의 살충성은 배양액의 경우 XR-DR, XR-NC, XR-PC는 18시간만에 100% 사멸시켰으며, XR-CR은 28시간, 그리고 XR-MK는 60시간 후에 100%로 치사시켰다. 또한 상등액의 경우는 XR-DR, XR-NC는 28시간만에 100%, 그리고 XR-PC, XR-CR은 38시간만에 100% 치사시켰으나 XR-MK는 60시간 후에도 80%만 치사시켰다. 즉 XR-DR과 XR-NC 배양 상등액의 살충성이 상대적으로 높은 반면, XR-MK의 살충성은 다소 낮게 나타났다.

Fig. 2는 공생박테리아 XR-NC와 XR-PC를 이용하여 꿀벌부채명나방 유충 성장에 대한 구강독성을 조사한 것으로써 공생박테리아 XR-NC를 첨가하지 않은 경우는 10여일 만에 약 190 mg 정도의 3령 유충으로 정상적으로 성장하였지만, XR-NC pellet을 유충배지 20 g당 건조중량 72, 144, 720 mg으로 첨가하고 25℃에서 증식한 경우 유충의 체중이 모두 정상적으로 증가하지 못하였다. 건조중량 72 mg을 첨가한 경우 최고 약 105 mg까지 체중이 증가한 반면, 144와 720 mg을 첨가한 경우에는 시간이 경과함에 따라서 체중이 거의 증가하지 못하였다. 또한 공생박테리아 XR-PC의 경우 배양액 pellet을 유충배지 20 g당 건조중량 23, 46, 230 mg으로 첨가하고 25℃에서 증식한 경우 유충의 체중이 모두 정상적으로 증가하지 못하였다. 건조중량 23 mg을 첨가한 경우 최고 120 mg까지 체중이 증가한 반면, 230 mg을 첨가한 경우에는 시간이 경과함에 따라 체중이 감소되었다. 또한 해충의 번데기, 나방으로의 생활사 진행에서도 큰 영향을 나타냄을 볼 때(data not shown), 공생박테리아는 해충의 구강으로 침투하여 충분히 해충을 사멸시킬 수 있는 능력을 가지고 추후 이런 특성을 이용한 해충방제 가능성을 확인하였다.

감사

본 연구는 과학기술부*한국과학재단 지정 계명대학교 전통 미생물자원 개발 및 산업화 연구센터의 지원에 의한 것입니다.

참고문헌

1. Park, S. H. and Kim, D. W.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 12(3), 261-268(1997).

2. Bedding, R. A. and Molyneux, A. S.: Nematologica 28, 354-359(1982).

3. Kaya, H. K. and Gaugler, R.: Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206(1993).

4. Dunphy, G. B. and Webster, J. M.: Int. J. Parasitol. 18, 729-737(1998).

5. Bowen, D. et al.: Science 280, 2129-2132(1998).

6. Leisman, G. B.: Appl. Environ. Microbiol. 61, 200-204(1995).

7. Hague, N. G. M. et al.: PCT/GB98/03254(1999).

8. Park, S. H. and Yu, Y. S.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 14(2): 198-204(1999).

9. Park, S. H. and Yu, Y. S.: Biotechnol. and Bioprocess Eng. 4(1): 11-15(1999).

10. Yu, Y. S. and Park, S. H.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 14(3): 303-308(1999).

11. Yu, Y. S. and Park, S. H.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 15(1): 100-105(2000).

12. Ryu, K. G., Bae, J. S., Yu, Y. S. and Park, S. H.: Biotechnol. and Bioprocess

Eng. 5(2): 141-145(2000).

Fig. 1. Comparison of mortality of XR-PC against Galleria mellonella larva at various culture times. Dilution ratio: (□) ×0, (▦) ×2, (▩) ×4, (☏) ×8.

Table 1. Comparison of pathogenicity of symbiotic bacteria after 36 hrs in

250 mL flask culture.

Strain/ O.D.(560nm)	Culture broth/ supernatant	Mortality / 5 larva used
		4hr	12	18	28	38	48	60
XR-DR 0.254	culture broth	0	0	5	5	5	5	5
	supernatant	0	0	0	5	5	5	5
XR-NC 0.287	culture broth	0	1	5	5	5	5	5
	supernatant	0	0	0	5	5	5	5
XR-MK 0.207	culture broth	0	0	0	0	3	4	5
	supernatant	0	0	0	0	2	4	4
XR-PC 0.290	culture broth	0	0	5	5	5	5	5
	supernatant	0	0	0	1	5	5	5
XR-CR 0.208	culture broth	0	0	0	5	5	5	5
	supernatant	0	0	0	3	5	5	5
Control	0.9% NaCl	0	0	0	0	0	0	0

Fig. 2. Oral toxicity of XR-NC and XR-PC to Galleria mellonella. Dose(mg/20 g feed): (A) XR-NC (○) control, (□) 72, (△) 144, (▽) 720. (B) XR-PC (○) control, (□) 23, (□) 46, (□) 230.