높은 유상비에서 Rhodococcus rhodochrous IGTS8를 이용한 탈황효율의 분석

최윤규, 김진홍, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Analysis of desulfurization efficiency by Rhodococcus rhodochrous IGTS8 in the presence of high oil phase

Yunkyu Choi, Jinhong Kim, Hongwoo Park

Department of Chemical  Engineering, Hanyang University

서론

현재 수소첨가 탈황법은 화석연료중의 황화합물을 제거하기 위한 가장 경제적인 방법이지만, 점차 엄격해지는 황함유량 규제에서 요구되는 고심도 탈황에는 부적합하다. 이로 인해 생물학적 탈황공정을 각국에서 개발중이며, Rhodococcus rhodochrous IGTS8, Gordona strain CYKS1, Paenibacillus sp. Strains A11-1, Rhodococcus sp. P32C1, Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 등의 균주들이 개발되어  상용화에 박차를 가하고 있다. 이러한 균주들은 유기황 중의 황만을 선택적으로 산화시켜 dibenzothiophene (DBT)을 2-hydroxybiphenyl(HBP)과 sulfate로 분해하는 특성을 갖고 있다. [1, 2]

연료중의 황을 대량으로 처리하기 위한 노력으로, 탈황유전자의 개량을 통한 탈황속도 개선, 휴식세포 또는 성장세포의 고정화를 통한 대량처리 등의 방법이 개발되고 있다. 그러나 상용화를 위해서는 처리되는 기름의 양이 사용되는 배지의 양에 비해 많아야 하는 것이 필수인데, 기름의 양이 증가할수록 탈황속도는 급격히 감소하는 것으로 보고되어 있어 높은 유상비에서도 적용할 수 있는 탈황공정의 개발에는 아직도 많은 연구가 필요하다.[3]

탈황 반응을 저해하는 원인에 대해 sulfate와 HBP의 영향을 조사한 연구가 많다. 기질로 사용하기 쉬운 황원인 sodium sulfate나 methanesulfonic acid 등의  존재하에서는 탈황효소의 생산이 억제되는데, 이는 dsz gene cluster의 발현이 조절됨으로써 일어나는 것으로 알려져 있다. 또 HBP는 세포에 독성이 있어 세포의 생장을 저해하고 탈황효율을 감소시킨다.이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 expert system을 사용하여 sulfate와 HBP의 양을 조절하여 세포의 양을 늘려 탈황효율을 증가시킨 연구도 시행되었다.[4, 5]

본 실험에서는 배지에 대한 기름의 비를 최대 50%가 되도록 하여 탈황효율을 떨어뜨리는 원인을 분석하고 이를 바탕으로 탈황효율을 높이는 방법에 대해 연구하였다.

재료 및 방법

균주는 Rhodococcus rhodochrous IGTS8(ATCC53968)을 사용하였다. 종배양을 위한 영양배지의 조성은 glucose 10g/L, yeast extract 0.5g/L, nutrient broth 8g/L이다. 본배양을 위한 minimal salt medium의 조성은 glucose 10g/L, glycerol 16g/L, KH2PO4 2.44g/L, Na2HPO4 5.57g/L, NH4Cl 4g/L, MgCl2□6H2O 0.4g/L, CaCl2□2H2O 0.002g/L, FeCl2□6H2O 0.002g/L, MnCl2□4H2O 0.008g/L를 사용하였다. DBT를 0.1, 0.2, 0.3%(w/v)의 농도로 녹인 hexadecane을 model oil로 사용하였으며 전체 배양액 중 배지에 대한 hexadecane의 부피비가 30%, 50%가 되도록 하였다. 본배양은 종배양한 균주를 1회 계대한 후 36시간 후에 0.1M phosphate buffer(pH 6.9)로 2회 세척하고, 배지내에서 초기 세포량이 0.40g/L가 되도록 접종하였다. 그 후 shaking incubator에서 28℃, 300rpm으로 96시간 배양하였다. 세포량은 분광광도계((Milton Roy, spectronic 20D)로 600nm에서 OD를 측정하여 dry cell weight로 환산하였다.

유상비가 50%인 배양은 플라스크 배양의 경우 300mL Erlenmeyer flask에 30mL의 배지와 DBT를 녹인 30mL의 hexadecane을 혼합하여 준 후 세포를 접종하였으며, 5L 배양기를 이용한 배양에서는 1L의 배지와 DBT를 녹인 1L의 hexadecane을 혼합한 후 세포를 접종하였다.

DBT와 HBP는 배양액 중 오일상 300[eqn: mu L]를 ethyl acetate로 5배 희석하여 HPLC로 분석하였다. [eqn: mu]Bondapak C18 steel column(3.9mm×150mm, Waters)을 장착하고 photodiode array detector(Waters 996)를 이용하여 260nm에서 분석하였으며 이동상은 acetonitrile/water (60:40v/v)을 사용하여 0.7mL/min의 유속으로 흘려주었다. HBP와 DBT의 retention time은 각각 3.6, 11.6 min이었다.

결과 및 토론

탈황특성

Fig. 1에서 보이는 바와 같이 유상비가 50%일 경우는 플라스크 배양이거나 배양기를 이용한 배양이거나 탈황되는 특성이 거의 비슷하여 25~30%의 DBT가 분해된다. 유상비가 30%일 때는 탈황효율이 58.2%로 유상비가 50%일때보다 효율이 높았다. 유상비가 30%일 때와 50%일 때 모두 배양 시작후 48시간이면 탈황속도가 급격히 감소하는 특성을 보였다.

오일상의 기질과 부산물이 탈황효율에 미치는 영향

Fig. 2에서는 오일함유비와 DBT의 농도를 고려하여 투입되는 DBT의 총량을 달리하여 실험하였다. 30% 오일함유배지에서는 1,000ppm과 2,000ppm의 농도에서는 분해되는 DBT의 총량이 같고 3,000ppm에서는 총량이 적었다. 그러나 50% 오일함유배지에서 1,800ppm의 DBT가 들어있는 조건은 30% 오일함유배지에서 3000ppm의 DBT가 들어있는 조건과 같은데, 같은 양이 분해됨을 확인할 수 있었다. 따라서 오일상에 있는 DBT의 독성에 의해 탈황이 저해받는 것이 아니라 세포가 처리할 수 있는 DBT의 절대량의 한계 때문에 높은 DBT 농도에서 효율이 떨어지는 것처럼 보이는 것임을 알 수 있었다.

Fig. 3은 HBP의 축적이 탈황에 미치는 영향을 조사하기 위해 2.5∼18mM의 HBP를 30%의 오일을 포함한 배지에 첨가해 준 실험으로, 9mM 이하의 농도로 HBP가 첨가되었을 경우에는 탈황효율에 영향을 끼치지 않았다. 현재의 실험 조건에서 DBT에 의해 생성될 수 있는 최대의 HBP 양은 5.43mM 이므로 오일상에 축적되는 HBP의 양에 의해 탈황반응이 정지하는 것이 아님을 알 수 있었다. 이는 탈황효율을 떨어뜨린다고 알려진 HBP의 농도보다 많은 양인데 HBP의 대부분이 hexadecane에 녹아 세포에 직접 미치는 영향이 적기 때문인 것으로 사료된다.

Fig. 4는 30%의 오일을 포함한 배지에서 배양후 48시간, 96시간째에 배지를 교환하여 탈황율을 측정한 실험으로, 배지교환을 통해 탈황율을 증가시켰다. 위의 결과를 종합해 보면 오일상이 아닌 수상에 탈황을 정지시키는 원인이 있을 가능성이 높다고 할 수 있다.

배지상의 기질과 부산물이 탈황율에 미치는 영향

오일함유비가 높은 배양조건에서, 배지에 축적되는 sulfate의 영향이 탈황율에 미치는 영향을 조사하기 위해 2mM이하의 sulfate를 배양 24시간 이후에 첨가한 실험에서는 탈황율이 크게 영향받지 않았다. 배양 초기에 배지내에 축적되는 sulfate를 제거하기 위해 CaCl2를 배지에 10~30배의 과량으로 첨가한 실험 또한 탈황율에는 큰 차이가 없었다. Ion chromatography 분석 결과 배양액의 sulfate의 양이 매우 적었으며 시간에 따라 불규칙하게 증가하였다. 따라서 오일함유비가 높은 배양조건에서는 sulfate의 축적으로 인한 탈황효율의 저하는 그리 크지 않음을 알 수 있었다.

기질의 부족 때문에 탈황반응이 정지하는지 알아보기 위해 HPLC를 이용하여 당분석을 한 결과 glucose와 glycerol은 초기 농도의 50% 정도가 남아있었다. Fig.5에서는 50%의 오일을 포함한 배지에 질소원을 3배 강화해 준 실험인데 대조군의 효율이 25.6%인데 비해 효율이 31.9%로 증가했는데, 이는 세포의 양이 탈황율에 크게 영향을 미치는 것을 나타낸다. 세포접종량을 기존 실험의 두배인 0.8g/L로 한 배양에서는 초기탈황속도는 거의 같았으나 탈황반응이 지속되는 시간이 길어져 결과적으로 탈황효율이 40.3%로 증가하였다.

높은 유상비의 미생물 탈황공정에서 성장세포를 이용했을 때 탈황효율이 낮은 것은 탈황반응이 배양 후 빠르게 종결되기 때문에 발생하며 이는 배지중의 독성물질의 축적과 세포량의 부족이 가장 큰 원인이다. 따라서 배지를 교환하고 초기세포접종량을 증가시켜 줌으로써 효율을 올릴 수 있었는데, 실제 공정에서는 반응이 끝난 배지를 회수하여 독성물질을 제거하고 재활용시켜 경제성을 향상시킬 수 있을 것이다. 이를 위해서는 정확한 독성물질의 파악과 제거 방법의 연구가 진행되어야 하며, 아울러 이상계에서 세포의 절대량을 늘리는 방법에 대한 연구도 필요하다.

감사

본 연구는 에너지관리공단의 청정에너지기술개발사업에 의한 지원으로 수행되었으므로 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. M. Kishimoto,  M. Inui, T. Omasa, Y. Katakura, K. Suga, K. Okumura,

Efficient production of desulfurizing cells with the aid of expert system, J. Biochem. Eng. 5 (2000) 143-147

2. S. Maghsoudi, M. Vossoughi, A. Kheirolomoom, E. Tanaka, S. Katoh, Biodesulfurization of hydrocarbons and diesel fuels by Rhodococcus sp. strain P32C1,  J. Biochem. Eng. 8 (2001) 151-156

3. J. H. Chang, Y. K. Chang, H. W. Ryu, H. N. Chang, Desulfurization of light gas oil in immobilized-cell systems of Gordona sp. CYKS1 and Nocardia sp. CYKS2, FEMS microbiol. letters 182 (2000) 309-312

4. C.S. Piddington, B.R. Kovacevich, J. Rambosek, Sequence and molecular characterization of a DNA region encoding the dibenzo-thiophene desulfuri-zation operon of Rhodococcus sp. Strain ITS, Appl. Environ. Microbiol. 61 (1995) 468-475

5. T. Ohshiro, K. Suzuki, Y. Izumi, Regulation of dibenzothiophene degrading enzyme activity of Rhodococcus erythropolis D-1, J. Ferment. Bioeng. 81 (1996) 121-124

Fig. 2. The effect of DBT amount

Fig. 1. Batch culture in 30% oil

phase and 50% oil phase

Fig. 5. The effect of Nitrogen enrichment

and increase of cell inoculation

Fig. 4. The effect of medium change

Fig. 3. The effect of HBP

amount