면섬유의 환경친화적 전처리공정을 위한

Glucose Oxidase를 이용한 호발폐액의 Enzymatic Recycling

신영섭, 최헌식, 안익성

연세대학교 화학공학과, 생물 환경공학 연구실

Enzymatic Recycling of Starch-containing Desizing Liquor by Glucose Oxidase

for the Preparatory Processes of Cotton Fabrics

Young Seob Shin, Heon Sik Choi, Ik Sung Ahn

Bio Environ. Engg. Lab., Yonsei Univ. Korea

서론

최근에 들어 환경친화적인 관점에서 바이오테크놀러지를 섬유산업에 도입하고 있다. 효소반응을 응용하는 바이오테크놀러지는 오염 유발형, 에너지 과소비형 화학공정을 환경친화적이면서 에너지 절약형인 생물 공정으로 대체할 수 있는 기술로 각종 산업 분야에서 각광을 받고 있다. 특히 섬유산업에서는 생산공정의 폐수 유발, 용수 사용량, 에너지 사용 등을 리스트화하여야 하는 환경규제 등이 수출과도 직결되는 시점이 다가오고 있다. 최근 가수분해 효소를 사용한 천연섬유의 정련 및 가공은 섬유산업 분야에 대한 biotechnology-based 저오염 가공기술의 다양한 응용 가능성을 보여주고 있다. 효소처리에 의한 공정의 주 장점은 40-50℃ 저온반응에 의한 에너지 절약 및 화학 약품 사용의 감소로 인한 수질오염 물질의 감소에 있다.

특히 제직 혹은 편직 공정중에 가해진 호제 가운데 전분의 경우는 □-아밀라제 혹은 아밀로글루코시다제 효소를 이용하여 포도당 단위로 분해 (식 1)한 후 이를 glucose oxidase(GOD)로 처리하면 포도당 산화물과 과산화수소를 발생 (식 2)할 수 있으므로 바이오 표백공정에의 응용연구도 진행되고 있는 실정이다[1].

전 분 → 포도당                                                    (1)

포도당 + H2O + O2 → 포도당 산화물 + H2O2                        (2)

본 연구는 면섬유 전처리 과정에 사용되는 호제의 주성분인 전분의 효소에 의한 제거로 인한 부산물인 포도당을 활용하는 방안으로 GOD에 의한 H2O2 생산을 목표로 한다. 유리효소의 최적 반응조건과 반응 산물로서 생기는 H2O2 와 gluconic acid(GA)의 반응 Inhibition에 대해 조사를 하였고, Glucose Oxidation 반응에 대한 수학적 해석을 통한 폭넓은 이해를 추구하였다.[2]

실험

Glucose Oxidation의 Optimum 조건 결정

반응에서의 최적 pH값을 결정하기 위하여 0.05M Potssium Phosphate buffer(PPB, sigma)를 pH 5.0, 5.5, 5.7, 그리고 6.0으로 각각 제조하고, 동일한 pH의 0.05M PPB로 GOD(G-7141 From Aspergillus, sigma) 각각의 stock solution (GOD 약 0.815 g/L, 200 unit)을 제조하였다. 이 효소 용액1ml를 취하여 1M의 Glucose(sigma)용액 29ml에 섞고 반응 온도 37℃에서 Auto-Stat titration (718 STAT Titrino. Metrohm.Swiss)을 사용하여 일정 pH에서 교반 실험하였다. GOD에 의한 glucose oxidation 반응의 물질수지는 아래의 식 (3) 으로 나타낼 수 있다.

[eqn: Glucose ~+~O_2 ~+~H_2 O ~~ buildrel rarrow {GOD } ~~Gluconic~ acid ~+~H_2 O_2]                      (3)

식 (3)에서 보면 glucose oxidation에서 생긴 부산물인 GA로 인해  반응 pH가 떨어짐을 막기 위해서 10mM NaOH로써 pH를 유지시킨다. 또한, Glucose Oxidation에서 O2는 반응 용액에 Air pump를 통해 공기를 주입하였다. 최적 온도 결정에서는 pH 5.7에서 반응 온도를 각각 32℃, 37℃, 42℃ 로 하여 반복 실험하였다.

Glucose Oxidation 실험

반응 system 내의 효소 농도를 높임으로써 표백 공정에 사용하고자 하는 높은 H2O2의 농도를 얻기 위해 0.1M의 PPB(pH 5.7)로 1M Glucose용액을 만들고 GOD 4000 unit이 녹아있는 0.1M PPB(pH 5.7) 1ml를 섞는다. 반응 온도 37℃에서 공기를 air pump로 주입하여 실험하였다[3]. 소비된 NaOH(0.05M) 양의 측정을 통해 glucose의 반응 정도를 파악하고, 채취한 sample의 UV 발색 실험(UV-160A spec, Simadzu)을 거쳐[4], 잔존 glucose와 H2O2의 농도를 측정하였다.

End-products의 영향 연구

Glucose Oxidation의 end-products인 GA와 H2O2가 효소의 반응에 미치는 영향을 조사했다..

결과 및 토론

Glucose Oxidation의 Optimum 조건

그림 1은 Glucose oxidase 최적 pH조건을 결정하기 위해 실험한 4가지 pH중에서 최적의 pH가 5.7임을 보여준다. 그림 2에서 보면, 최적 온도 조건을 결정하기 위해 32℃∼42℃ 사이의 온도에 대해 glucose oxidation 실험을 한 결과 최적의 반응 온도는 37℃임을 알 수 있다.

Glucose Oxidation

위의 조건에서 고농도의 H2O2를 얻기 위해 효소 농도를 높여 실험을 하였다(그림 3), 이 때 반응기 내의 H2O2 농도는 그림 4에 나타내었다. 생성된 H2O2는 농도가 0.003% (w H2O2/w H2O) 정도로 유지되는 것을 볼 수 있는데, 이는 본 실험에서 사용되는 반응 조건에서 H2O2가 포화되었음을 보여준다.

또한 반응 온도 37℃ 에서는 과산화수소가 안정하지 못하여 아래와 같은 분해가 일어나는 것으로(식 4) 알려져 있다. 첨가되는 NaOH로 인해 더 빠르게 분해될 수 있기 때문에, 포화농도 이상에서는 분해 반응을 거쳐 일정한 값 이상으로 얻어지지 않는 것임을 추측할 수 있다[5]

[eqn: 2H_2 O_2 ~~ -> ~~2H_2 O~+~O_2]                                        (4)

그림 3에서 보면 glucose oxidation에서 잔존 glucose의 농도도 시간에 따라 차츰 감소하지만, 그 감소 속도 또한 시간에 따라 줄어드는 것을 볼 수 있는데, 이는 GOD의 활성이 시간에 따라 점차 감소한다는 것을 보여준다. 초기 Glucose oxidation 반응에서 소비된 기질 농도를 minute 단위로 나누어  Sigma사에서 제시한 activity와 비교할 수 있었다. 30분 동안 소비된 기질의 농도는 약 0.027M 이었으며 이로부터 반응 용액 내 효소의 활성은 약 900 unit/mL라고 계산되었으며, 4000 unit을 사용하였으므로 1unit이 분당 분해한 기질의 농도는 2.27×10-7M 이다. 이는 Sigma사에서 제공한 자료에 의해 계산된 4000 unit/mL 의 22% 정도에 지나지 않는다. 이는 Oxygen Limitation의 영향에 의한 것이라 추정되며[5], GA 와 H2O2의 저해 영향에 의한 것이 아님을 실험을 통해 알 수 있었다.

Glucose Oxidation 반응의 수학적 해석

Glucose oxidation 반응의 kinetics를 수학적으로 해석하여 가입된 GOD의 실제 활성도와 반응제한 인자 파악 및 최적화 변수 도출을 목표로 하였고, 사용된 식은 효소반응에 대한 가장 간단한 Michaelis Menten 식을 이용하였다.[2]  반응 중 가입되는 NaOH에 의해 부피의 변화가 크기 때문에 부피변화를 고려하였다(식 5).

[eqn: S~ =~ {S_0 V_0} over {V_0 ~ +~V_t }~-~{M_NaOH V_t } over {V_0 ~+~V_t }]                                   (5)

S : Glucose 몰농도            V0 : 초기 반응 system의 부피

Vt : 가입되는 NaOH의 부피    MNaOH : 가입되는 NaOH의 몰농도

Glucose의 농도 변화를 보면 반응 초기에는 빠른 속도로 감소하다가 반응 시간이 지나면서 점차로 기질 감소 속도가 줄어듦을 그림 4를 통해 알 수 있다. 그림 5,6에서 반응시간에 따라 NaOH의 가입속도가 점차적으로 줄어들고 있음을 알 수 있다. 이는 효소 활성이 감소하거나 산소의 limitation 때문인 것으로 추정하고 있다. Glucose oxidation의 수학적 해석을 위해 Michaelis Menten Equation은 아래와 같다[2]

[eqn: M.M. Equation~=~- d[S] over dt ~= ~{k[E]_0 [S]} over {K_m +[S]}]           [eqn: [E]_0 ~=~{[E]_0 ^' V_0 } over {V_0 +V_t }]           (6)

식 6의 [E]0는 농도 Ct(0,05M)의 NaOH 적정액이 시간 t동안 Vt만큼 들어감에 따라 original [E]0'의 희석된 값이다.

[eqn: dV_t over dt ~=~ {k[E]_0 ^' V_0 } over {V_0 C_t + [S]_0 V_0 }· {([S]_0 V_0 - C_t V_t )·(V_0 + V_t )} over {(K_m V_0 +[S]_0 V_0 )+(K_m - C_t )·V_t }]              (9)

∴ [eqn: t~=~a×ln{ (b-V_t )} over b ~+~c×ln{(V_t +d)} over d]                                (10)

[eqn: a + b ~=~{C_t ·{k[E]_0 V_0 } over {C_t V_0 + S_0 V_0 }} over {C_t - K_m }]         [eqn: b ~=~ { S_0 V_0 } over C_t]         [eqn: c~=~ S_0 V_0]

전체 반응 data는 간단한 M.M.식으로 설명할 수 없었다. 이는 M.M.Equation은 하나의 기질에 대한 식으로 Km은 상수인데 반해, 실제는 산소와 glucose 두 가지 모두 GOD의 기질로 작용하기 때문이라고 추정할 수 있다. 또한 glucose oxidation 실험 중에 O2 limitation 문제가 발생하므로 glucose 만을 limiting substrate로 가정한 식 6은 본 실험 결과를 설명할 수 없다. 반응 초기에는 O2 limitation을 받지 않았을 것으로 추정하여 초기 반응 data를 Fitting 해보았다 (그림 6). 초기 반응 data의 fitting에서 얻어진 Km값과 k[E]0값은 각각 다음과 같다.

Km = 0.026566763 g [S]/ml                k[E]'0 = Vm = 0.059494643 g/ml min

그림 7은 반응 시간을 길게 한 실험을 각각 구간별로 나누어 fitting하고, Vm과 Km값을 구해보았다. 반응 시간이 지남에 따라 Vm값은 증가하고, Km값은 감소하는 것을 볼 수 있는데, Km값은 O2의 function이므로 반응 용기 중 산소 limitation에 의해 Km값은 감소하는 것을 볼 수 있다[6]. 만약 과잉 산소를 공급할 수 있다면 O2 factor는 상수화 되어 Km값은 constant할 것이라 추정할 수 있다(식 9).

산소를 공급함으로써 실험에서 나타난 O2 limitation을 해결하고, 생성된 H2O2의 회수 방법을 모색하는 연구가 필요하다고 보여진다. 아울러 효소의 재사용을 의한 Glucose oxidase의 최적 고정화를 위한 담채를 선정하고, 고정화 효소의 반응에 대한 pH와 온도의 영향을 연구도 필요하다. 또한, GOD에 의한 glucose 산화 반응이 glucose와 산소라는 이중 기질 시스템이므로, Michaelis Menten 식을 변형한 수학적 해석도 얻어질 수 있다고 본다.

참고문헌

1. Klaus Opwis 외 5 Starch/St□rke 51 (1999) Nr. 10,S. 348-353 Wiley-VCH Verlag GmbH

2. M, L. Shuler 외 1 Bioprocess Engineering Basic Concepts Prentice-Hall, Inc. (1992)

3. Paul D. Boyer 외 2  The Enzymes vol.8  Academic press (1963)

4. Yutaka Saito 외 5  Talanta Vol 34 No. 7, 667-669 1987 Printed in Great Britain

5. H. Schacht , W. Kesting Perspektiven Enzymeatischer Prozesse in der Textilveredlung       Textilveredlung 30, (1995)

6. James E. Bailey 외 1 Biochemical engineering fundamentals McGraw-Hill Inc. (1986)

그림1. Glucose Oxidationd에 대한 pH의 영향, 37℃      그림2. Glucose Oxidation에 대한 온도의 영향, pH 5.7

그림3. Glucose Oxidation 에 따른 NaOH 가입량의 증가           그림4. 반응기 내의 H2O2의 농도의 변화

그림5. 잔존 Glucose 농도의 변화                          그림6. 잔존 Glucose 농도의 변화

그림7. 초기 Glucose oxidation data의 Fitting               그림8. 시간에 따른 Km값과 Vm값의 변화