이온교환 칼럼 크로마토그래피를 이용한 난백에서 Lysozyme의 분리·정제

허 윤석, 정 은미, 김 인호

충남대학교 공과대학 화학공학과

The purification of Lysozyme from Egg White by Ion Exchange         Column Chromatography

Yun-Suk Huh, Eun-Mi Jung and In-Ho Kim

Department of Chemical Engineering

Chungnam National University, Taejon 305-764

서론

Lysozyme은 1922년 Alexander Fleming에 의해 최초로 발견된 용균효소로서, Micrococcus lysodeikticus같은 세균이나 다른 그람 양성세균과 음성세균등을 용균시키는 특성을 갖는 효소로 처음 보고하였다[1]. Lysozyme은 용균작용 이외에도 Virus의 불활성화[2]와 단백질의 소화 흡수촉진 등의 효과가 있어, 식품의 보존료와 의약품원료 및 유아식의 영양강화 부문에 사용하고 있다.

이상과 같이 유용한 천연물질인 Lysozyme은 동물의 조직, 체액, 식물 및 미생물 등에 널리 분포되어 있지만, 난백 중에 함량이 약 0.3%로 가장 높다. 난백은 다른 Lysozyme함유물질에 비하여 생산량이 풍부하며, 추출조작이 비교적 용이하기 때문에 Lysozyme 추출원료로 가장 적합한 것으로 알려져 있다[3].

난백에서 Lysozyme의 추출은 직접결정화법, 친화성 크로마토그래피법, 이온교환 크로마토그래피법 및 한외여과법 등이 시도 되어왔다. 이중에서 이온교환 크로마토그래피법은 수율 및 순도가 높아 산업적으로 이용되고 있다.

이 연구에서는 양이온교환수지로 난백에서 Lysozyme 추출시 수율과 순도등을 알아보고, 수지의 작동 용이성 등을 확인해 보려 한다. 본 실험에서는 Cellufine C-200 양이온교환수지를 선택하여 Lysozyme을 4회까지 반복해서 정제해 보았다. 용출획분의 단백질 농도를 정량한 후, 그 결과들을 전기영동을 이용하여 확인해 보았다.

재료 및 방법

1. 난백의 준비(리조짐 용액)

일반 시장에서 구입한 달걀을 난백과 난황으로 분리한후 난백만을 모아 증류수로 10배 희석한 후 원심분리기를 이용하여 8,000rpm, 30분간 작동하여 불용성의 물질은 제거하고 상등액을 취하여 주입 시료로 사용한다.

2. 크로마토그래피

사용한 칼럼은 25mm ID × 330mm L 유리칼럼(Spectra/chrom co.)을 사용하였고 양이온교환수지로는 Cellufine C-200을 이용하였다. 이 수지의 작용기는 Carboxy- methyl group이고 Counter ion은 Sodium을 사용하였다. 완충용액은 pH 8.0, 15 mM 인산 완충 용액을 평형 용액으로 하고 여기에 1M 소금을 첨가하여 용리 용액으로 사용하였다.

Fig. 1과 같은 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 난백으로부터 Lysozyme을 분리하였다. 즉, 준비된 난백을 칼럼에 통과시켜 Lysozyme을 흡착, 용출함으로써 정제된 Lysozyme의 용출획분을 얻었다. 여기서 반복정제는 평형, 시료 주입, 세척, 용리를 1 주기로 하여 반복함으로써 수지의 용이성을 실험하였고, 크로마토그래피 실험과정은 Table 1에 요약되어 있다.

Table 1. Experimental conditions of column chromatography.

Resin bed volume	12.3 ml
Flow rate and time
equilibration	4.5 ml/min for 15min
sample loading	1.5 ml/min for 50 min
washing	4.5 ml/min for 15 min
elution	1.5 ml/min for 30 min
Equilibration and washing buffer	15 mM sodium phosphate buffer(pH 8)
Elution buffer	15 mM sodium phosphate buffer with 1.0 M NaCl

Fig. 1. Flow chart of multicycle column chromatographic purification of lysozyme from egg white; buffer 1 : 15 mM sodium phosphate buffer (pH 8), buffer 2 : 1.0 M NaCl.

3. 분석방법

단백질 함량은 Lowry method를 이용하여, 750 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 그리고 Lysozyme의 확인과 순도는 15% Acrylamide SDS- PAGE를 이용하였다.[4]

4. 실험장치

Fig. 2는 사용한 장비의 모식도이다.

Fig. 2. Equipment of column chromatography; 1: Pump, 2: Column, 3: UV detector, 4: Fraction collector, 5: Digital multimeter, 6: Computer.

결과 및 토론

난백에서 Lysozyme을 분리한 크로마토그래피 결과는 Fig. 3과 같다. 1 주기가행되면서 수지에 흡착되지 않는 단백질과 용출 buffer에 의해 Lysozyme이 잘 분리되고 있음을 Fig. 4의 전기영동 결과로 알 수 있다.

Fig. 3. One cycle chromatogram for purification of lysozyme from egg white; ⓐ: sample loading, ⓑ: washing, ⓒ: elution.

크로마토그램에서 71∼80 분에 해당하는 Fig. 4의 Sample No. 6∼10까지는 비교적 Lysozyme이 순수하게 용출되었음을 볼 수 있었다. 그러나 80분 이후로는 여러 단백질이 함께 용출됨을 알 수 있었다.

각각의 Fractions을 750 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 분석을 실시한 결과는 Fig. 5와 같다.

Fig. 4. SDS-PAGE of elution fraction; No. 1 : loading sample,  No. 2 : fraction of 20 min, No. 3 : 40 min,  No. 4 : 60 min, No. 5∼13 : eluted fractions.

Fig. 5. Result of elution fraction;No. 1 : loading sample, No. 2 : fraction of 20min, No. 3 : 40 min,  No. 4 : 60 min, No. 5∼19 : eluted fractions.

여러 주기로 실험을 반복하면서 본 실험의 이온 크로마토그래피의 재현성을 살펴보기 위해 크로마토그램 중 세척주기의 끝점과 용출끝점의 흡광도값을 비교하여 보았다. Table 2에서 보는바와같이 세척주기는 4 cycle까지 20%이하의 비교적 안정된 값을 보여주었지만, 용출끝점의 경우는 3 cycle부터 20%이상의 값을 보이며 용출능력이 현저하게 감소함을 볼 수 있다.

Table 2.  Variation of absorbance(254 nm) values at the end of

washing and elution steps according to cycle increase .

Cycle	Absorbance at the end of washing step (percentage of maximum peak value)	Absorbance at the end of elution step (percentage of maximum peak value)
1	0 (0)	0.08 (3)
2	0 (0)	0.21 (14)
3	0.46 (14)	0.6 (24)
4	0.6 (15)	0.17 (41)

참고문헌

1. Gluseppe Ghielmetti, and Cario Trinchers., United States Patent,

3515643(1970).

2. Yohitaka, M. : Egg white lysozyme Its chemistry and application. J. Jap.     Soc. Food and Nutr., 24(6), 311(1971).

3. 김인호: "생리 활성 물질의 대량 분리 정제 기술 개발", 과학 기술처, 1995

4. Jeffrey M. Becker: "Biotechnology", 2nd ed., Academic Press(1996).

5. 박성준·김현석·김현위·안태희·박기문·최춘언: 이온교환 칼럼 크로마토그     래피를 이용한 난백에서 Lysozyme의 연속추출, Kor J. Food SCI. Technol.,     22(6), 711(1990).