효소를 이용한 solvent-free two-phase system에서

ketoprofen ester의 광학 분할

진 주남, 이 선복

포항공과대학교 화학공학과

Enzymatic hydrolysis of ketoprofen esters

in a solvent-free two-phase system

Ju nam Jin and Sun Bok Lee

Department of Chemical Engineering,

Pohang University of Science and Technology

서론

Solvent-free system은 용매를 사용하지 않고 필요한 기질만으로 구성된 시스템으로 반응 부피를 최소화함으로서 친환경적인 효과를 얻을 수 있고, 장치 설계 및 구성면에서도 비용을 절감할 수 있는 등의 여러 가지 장점을 가지고 있다.1), 2) 이 시스템의 적용 예는 아직까지 지방산과 글리세롤을 이용한 글라이세라이드 생산이나 왁스 에스테르 생산이 대부분이다. 또한 광학 분활에 대한 연구에도 이용되고 있으나, 에스테르화 반응에 제한적으로 적용되고 있다.

오늘날 미국 FDA의 규제가 강화됨에 따라 향후 광학 활성 의약품은 약리 활성이 없거나 독성을 가지는 enantiomer가 제거된 순수한 enantiomer형태로 판매될 것이라는 전망 아래, 광학적으로 순수한 의약품 생산에 대한 관심이 점점 고조되고 있다. 따라서 다양한 형태로 연구되고 있으나, 아직 solvent-free system를 이용한 연구는 미미한 실정이다.

Ketoprofen[(R,S)-2-(3'-benzoylphenyl)propionic acid)]은 비스테로이드계 소염제로서 류마티즘, 관절염의 진통제나 해열제 등 다양한 형태로 이용되고 있어 날로 그 수요가 증가하고 있는 추세에 있다. 지금까지 ketoprofen에 대한 연구가 많이 이루어졌지만 대부분 용매내에서의 반응으로 에스테로화 반응이나 짧은 chain 알콜을 통해 만들어진 ketoprofen methyl(ethyl) ester의 가수분해 반응 연구가 대부분이다.

본 연구에서는 물과 ketoprofen decyl ester에 의해 형성된 two-phase에서 효소를 이용한 가수 분해 반응에 관한 연구를 통하여 solvent-free two-phase system을 구축하고, ketoprofen methyl ester와 hexyl ester를 이 시스템에 적용시켜 광학분할에 대한 효용성을 입증했다. 이로서 solvent-free two-phase system이 산업적으로 다른 유용한 물질 생산에도 적용될 수 있을 것으로 본다.

실험 장치 및 방법

Ketoprofen ester 합성

Ketoprofen은 여러 가지 alcohol과 높은 온도에서 자발적으로 ester를 합성하는 현상을 발견하고 이를 이용하여 ketoprofen과 decanol, hexanol을 90℃ 항온 교반조에서 각각 7일간 반응시켜 ketoprofen decyl ester, hexyl ester를 합성했다. 실리카겔로 충진된 flash chromatography (hexane : ethyl acetate = 16 : 1)를 이용하여 순수한 ketoprofen ester 분리할 수 있었고, 분리된 ketoprofen ester는 TLC (thin layer chromatography)와 1H-NMR로 확인했다. Ketoprofen methyl ester는 기존 문헌에 나온 방법에 따라 얻을 수 있었다.3)

Solvent-free two-phase system에서 가수 분해 반응

효소를 이용한 ketoprofen decyl ester의 가수분해는 ester층과 물 층으로 구성된 solvent-free two-phase 시스템에서 수행되었다.  물 층에는 반응 생성물인 ketoprofen을 효과적으로 제거하기 위해서 1M NaHCO3을 넣었다. Ketoprofen decyl ester의 광학 분할을 위한 효소는 Candida antarctica type B lipase의 고정화된 형태인 Novozym 435 (Novo industries, Denmark)를 이용하였다. 분석은 ester층과 물 층의 samples을 각각 acetonitrile, 증류수에 희석하여 C18 column (Waters, Nova-pak□) 과 Chiral column (Phenomenex, 00G-3005-D0)을 이용한 HPLC로 하였다.

Fig. 1 Scheme of enzymatic hydrolysis in a solvent-free two-phase system

결과 및 고찰

Ester층과 물 층으로 구성된 two-phase system에서 ester는 기질로 작용함과 동시에 반응 medium으로 작용하고 물 층은 가수 분해 반응에서 기질로만 작용하는 시스템을 구성했다. 효소는 Lipozyme IM (Rhizomucor miehei), Lipase OF (Candida rugosa), Novozym 435 (Candida antarctica)를 이용하여 이 시스템에 적용시켜 보았으나, Lipozyme IM과 Lipase OF는 두 기질과 접촉하지 못하고 물 층에만 존재했다. Novozym 435의 경우 고정화 된 resin (acrylic resin)4)이 hydrophobic해서 효소가 ester 층에 존재할 수 있었다. 그러나 Novozym 435를 이용하여 순수한 증류수와 ester를 반응시켰더니, reation rate와 final conversion이 매우 낮았다.

대부분의 효소 반응은 가역 반응이므로 생성물을 제거하면, 화학 평형적으로 원하는 반응쪽으로 유리하기 때문에 conversion과 reaction rate를 증가할 수 있다. ketoprofen decyl ester의 가수 분해반응에서는 ester 층에 존재하는 생성물 중 ketoprofen을 염기를 이용하여 물 층으로 이동시킴으로 이러한 효과를 누리고자 하였다.

약염기인 1N NaHCO3, 강염기인 1N NaOH를 이용하여 실험을 수행한 결과, 증류수에서 ketoprofen이 거의 녹지 않으므로 ketoprofen이 대부분 ester층(97% 이상)에 존재하는 반면에 약염기인 NaHCO3 용액에서는 생성물인 ketoprofen을 신속하게 물 층 (99% 이상)으로 보내는 것으로 나타났다. (Table 1.) 이러한 ketoprofen의 분배의 차이에 의해 1N NaHCO3를 사용한 경우, 증류수에서 보다 2배 이상의 conversion을 증가시킬 수 있었다.  그러나 강염기인 NaOH를 넣었을 경우는 순수한 증류수와 비슷한 결과를 나타내었다. (Fig. 2)

Table 1. Properties of water phase

	D.W.	NaHCO3 ( 1N )	NaOH ( 1N )
pH	7.1	8.7	13.0
Ketoprofen solubility	very poor	good	good

Fig. 2 Effects of water phase composition on reaction rate. Reaction conditions: ketoprofen decyl ester:water = 4.9mmol(2ml):1.39×103mmol (25ml), 0.3g Novozym 435, at 70℃, 150rpm

온도에 대한 영향은 효소 자체의 활성과 깊은 관련이 있기 때문에 효소 반응에서 중요한 요인으로 작용한다. 이러한 영향을 알아보기 위해서 물 층을 1M NaHCO3 용액으로 구성하고, 다른 조건은 모두 앞과 동일하게 유지한 뒤 30, 50, 70℃, 세 온도에서 실험을 수행했다. 그 결과 30, 50℃에서 보다 70℃에서 initial rate와 conversion에서 훨씬 좋은 결과를 얻을 수 있었다(Fig. 3). 이는 70℃ 부근에서 Novozym 435의 활성이 우수할 뿐 아니라 (www. novozymes. com), 높은 온도에서 ketoprofen의 물에 대한 용해도가 증가하기 때문이라고 볼 수 있다.

Table 2. Effects of temperature on

enantioselectivity

	30℃	50℃	70℃
conversion(%)	7.0	12.4	20.5
eep(%)	71.8	65.4	58.4
E	6.5	5.2	4.4

Fig. 3 The effects of temperature on reaction rate

광학 분할에서 반응 속도나 conversion 이외에, enantiomeric excess도 고려해야 할 중요한 인자이다. Novozym 435는 (R)-ketoprofen에 대한 선택도를 보인다. 광학 선택도는 여러 가지 반응 조건에 따라 달라지지만 conversion과 온도, 용매 등의 영향을 많이 받는다. 대체로 conversion이 증가함에 따라 광학 선택도는 떨어지고, 온도는 시스템에 따라 다르다고 알려져 있다.(5) 본 실험에서 수행한 세 온도 조건에 따른 광학 선택도를 보면 높은 온도에서 선택도가 떨어지는 경향을 보인다(Table. 2). 그러나 시간에 따라 conversion 증가에 의해서는 큰 차이를 나타내지 않았다. 이러한 경향은 ketoprofen decyl ester의 경우 비교적 낮은 conversion을 유지하기 때문일 수도 있다

지금까지의 결과를 보면 ketoprofen decyl ester의 가수 분해 반응에서 반응 속도와 conversion이 비교적 낮은 경향을 보인다. 느린 반응 속도는 decyl ester와같은 long chain 알콜로 이루어진 기질에 대해 낮은 활성을 나타내는 효소의 특성으로 보여진다. 또한 final conversion측면에서는 생성물 중  decanol은 물과 섞이지 않기 때문에 반응이 이루어지는 ester층에 존재하고 ketoprofen만이 물 층으로 이동하게 됨으로 생성물을 제거하는 효과가 줄어들 수 있다고 생각했다. 따라서 본 실험에서는 short chain alcohol인 methanol과 hexanol로 이루어진 ketoprofen methyl ester와 hexyl ester를 solvent-free two-phase system에 적용해 보았다.

Table 3. Properties of ketoprofen ester acyl donors

alcohol	methanol	hexanol	decanol
molecular formula	CH3OH	CH3CH2(CH2)4OH	CH3CH2(CH2)8OH
water solubility	miscible	0.6 (g/100g H2O)	immiscible

Fig. 4 Effect of substrates on reaction rate. Reation conditions:  ketoprofen ester : water = 9.8mmol : 1.39×103mmol(25ml)

0.1g Novozym 435, at 50℃, 150rpm

동일한 실험 조건에서 methyl ester, hexyl ester, decyl ester에서 가수 분해반응을 수행한 결과, methyl ester의 conversion이 hexyl, decyl의 경우에 비해 매우 높게 나타났다(Fig. 4). 이는 hexanol, decanol은 물에 거의 녹지 않아서 가수 분해 생성물 중 ketoprofen만이 물 층으로 이동함에 반해 methanol은 물과 잘 섞이므로 생성물 모두가 반응이 일어나는 ester 층에서 제거됨으로서 반응 평형이 가수 분해 방향으로 유리하게 작용하는 것이라고 보여진다(Table 3). 반응 속도 측면에서도 methyl ester가 hexyl ester와 decyl ester에 비해 빠른 것을 알 수 있는데 이는 alcohol chain 길이가 효소 반응성에 영향을 미치는 것으로 볼 수 있다.

참고 문헌

1. G. D. Crescenzo, A. Ducret, M. Trani, and R. Lortie, J Mol Catal B-Enzym.,    9:49-56 (2000)

2. M. Trani, A. Ducret, and R. Lortie, Biotechnol Lett., 17:1095-1098 (1995)

3. M. G. Kim, E. G. Lee, and B. H. Chung, Process Biochem., 35:977-982 (2000)

4. P. Pepin, R. Lortie, Biotechnol Bioeng., 63:502-505 (1999)

5. R. S. Phillips, Trends Biotechnol., 14:13-16 (1996)