농축 전세포 CGTase 발효액을 이용한 당전이 반응

손준혁, 정재용, 박중곤

경북대학교 화학공학과

Transglycosylation Using Whole Cell CGTase from Concentrated Broth Solution

J.H. Sohn, J.Y Jung, J.K. Park

Department of Chemical Engineering, Kyungpook National University

서론

당전이(transglycosylation) 반응이란 당공여체로부터 glucose, fructose, galactose, xylose 와 같은 단당류가 적절한 당수용체로 전이되어 이들 당이 결합된 이당류 이상의 당전이 생성물을 만드는 반응을 말한다. 전이되는 당의 종류에 따라 transglycosylation, transfructosylation, transgalactosylation, transxylosylation, transglucosamination 등으로 나눌 수 있다. 이러한 당전이 반응에 관여하는 효소들 중 활발히 연구되고 있는 효소로 cyclodexrin glucanotransferase(CGTase)를 들 수 있다. 주로 bacillus 계통의 박테리아들로부터 생산되는 CGTase는 cyclization, coupling, disproportionation, hydrolysis 등의 여러 기능을 가진 효소이다. Intramolecular transglycosylation인 cyclization 반응은 starch에 작용해 분자내 전이작용을 촉매하여 glucose 6∼8개가 □-1, 4 결합으로 환상연결된 cyclodextrin을 합성하는 반응이다. coupling과 disproportionation 반응은 intermolecular transglycosylation 반응인데 coupling은 cyclodextrin을 개환하여 형성된 선형 malto-oligosaccharide를 다른 수용체에 부가하며 disproportionation은 선형 malto-oligosaccharide를 불균일화 하는 반응이다. 또 hydrolysis 반응은 starch와 cyclodextrin을 분해하는 반응이다. CGTase의 당전이 반응을 이용하면 여러 가지 유용한 기능성 당을 생산할 수 있는데 감미의 개선, 용해도의 증가, 화학적 안정성 증가 등이 그것이다.  Sato 등은 CGTase를 이용하여 inositol에 당을 전이시켜 얻은 당전이 산물이 Bifidobacterium에 증식효과가 있음을 보고하였고 Kitao 등은 glucose-1-phosphate를 이용한 당전이 xylitol이 충치균에 의한 glucan 생성을 억제하는 효과가 있음을 밝혔다. 또 Kim 등은 CGTase를 사용하여 xylitol을 당수용체로하는 당전이 반응으로 glucosyl-xylitol을 생산하는데 성공하였으며, 이렇게 생산된 glucosyl-xylitol이 Bifidobacterium breve에 대한 증식효과가 있음을 확인하였다.

CGTase를 생산하는 많은 박테리아들이 있는데, 그 중 대표적인 것은 Bacillus 종류의 박테리아들이며, 이들 박테리아들이 생산하는 효소는 Bacillus macerans ATCC 8514, 8515를 제외하고는 대부분 세포외 효소로 알려져 있다. CGTase는 크게 반응초기에 합성되는 CD의 종류에 따라 □,□,□ 세가지 종류로 분류할 수 있으나 효소반응이 진행됨에 따라 다른 두 종류의 CD들도 역시 같이 합성되어진다. 그래서 반응이 평형에 도달할 때는 거의 대개 □나 □-CD보다 열역학적으로 더 안정한 □-CD가 주요 최종산물이 된다.

본 실험실에서는 앞서 B. macerans(IFO 3490)를 배양한 배양액 전체를 10배로 진공 농축하여 캡슐내에 고정화하여 캡슐고정화 전세포 CGTase를 제조한 뒤 이 것을 이용하여 xylitol을 당수용체로 하고 dextrin을 당공여체로 한 glucosyl-xylitol을 생산하였고 자유 배양액을 사용한 것 보다 높은 수율을 얻었다.

이번 연구에서는 세포외 효소인 CGTase를 생산하는 B. macerans(IFO 3490)를 배양하여 복잡한 정제 과정을 거치지 않고 단순히 자유 배양 용액을 진공농축하였다. 이 진공농축된 전세포 CGTase를 starch를 당공여체로 사용한 반응용액에 투입하여 자유 배양액을 투입했을 때와 비교하여 CD를 생산하는 cyclization반응, glucosyl-xylitol을 생산하는 당전이 반응, 그리고 hydrolysis 반응에 어떤 차이가 있는지 알아보고자 한다.

실험

균주는 Extracellular Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 생산하는 것으로 잘 알려진 B. macerans(IFO 3490)를 KCTC로부터 분양 받아 사용하였다. 사용된 배지는 soluble starch를 첨가한 LB배지이다. 배양조건은 37□, 200rpm이고 shaking incubator에서 24시간 간격으로 계대배양하였으며 접종량은 10%(v/v)였다.

B. macerans(IFO 3490)이 생산하는 CGTase의 □-CD 합성 활성은 50mM Tris-malate-NaOH buffer 0.4mL와 10(w/v)%의 soluble starch 0.5mL에 미생물 배양액을 넣어 반응시킨 후  Phenolphthalein 용액(20mg/100mL)을 첨가하고 Na2CO3 용액(1g/100mL)을 첨가하여 발색시켜 550nm에서 투광도(transmittance)로 합성된 □-CD의 양을 측정하여 계산하였다. 효소의 활성은 분당 1□의 □-CD를 생산하는 효소의 양을 1 unit으로 정의하였고 검량 곡선은 □-CD(MW 1135.0, Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 작성하였다.

CGTase의 cyclization, hydrolysis, transglycosylation 반응을 측정하기 위해 반응생성물은 high performance liquid chromatography(HPLC, Waters)를 사용하여 분석하였다. 반응혼합액은 soluble starch와 xylitol을 Tris-malate-NaOH buffer 5mL와 증류수에 녹인 다음 배양액 50mL 혹은 10배 농축된 농축액 5mL와 혼합하였다. 이렇게 만들어진 반응혼합액은 50□, 150rpm의 조건으로 12시간 동안 shaking incubator에서 반응시켰다. 1mL의 sample을 취하여 4mL의 증류수와 희석한 후 10분간 끓여 반응을 정지시켰다. 분석 조건으로 column은 Cosmosil 5NH2 packed column(Nacalai Tesque, Inc., Japan), 용출용매는 acetonitrile과 H2O(65:35)의 혼합용액, 용출속도는 1.0mL/min, detector는 RI detector를 이용하였다. 용매와 측정용 sample은 0.22□ filter를 이용하여 사용전 여과하였다. 반응생성물의 검량선을 작성해서 농도로 환산하였다.

농축은 rotary vacuum evaporator(EYELA NE-11)에서 실시하였다. 먼저 배양액(1000ml)을 10,000ml 용기에 담고, 진공상태를 유지한 후 분당 50회 정도의 속도로 회전하면서 농축한다. 농축비를 알기 위해서 점도가 높은 농축액을 정량하면 오차가 커서 포획된 양으로 농축비를 측정하였다. 여기서 rotary vacuum evaporator의 냉각기에 붙어 있는 수분들에 의한 오차를 줄이기 위해 증발량과 포획량의 검량선을 작성했다.

결과

농축액의 활성 변화를 살펴보기 위하여 농축 전후의 활성을 30분 동안의 □-CD 합성 활성으로 비교하였다. 자유 배양액과의 비교를 위해 10배 농축액을 증류수로 10배 희석해서 측정했다. Table 1에서 보듯이 농축 과정에서 □-CD 합성 활성이 약 42% 증가했다.

Table 1. The production of □-CD by CGTase which remains in the broth solution before and after concentration

	□-CD production(unit/mL)
	Broth solution	Concentrated broth solution
Sample 1	21.97	31.57
Sample 2	22.07	31.80
Sample 3	23.00	32.27
Average	22.35	31.88

Fig. 1. The products by CGTase which remains in the broth solution before         and after concentration

농축 배양액과 자유 배양액을 사용해 12시간 동안 반응시킨 후 반응 생성물을 HPLC로 분석해서 Fig. 1에 나타내었다. 같은 unit의 효소를 투입했음에도 농축배양액을 사용한 경우에 반응이 더 다양하게 일어났다. Hydrolysis 반응에 의한 G2(maltose), G3(maltotriose)가 검출되었고 G1-X, G2-X, G3-X를 생산하는 transglycosylation 반응이 일어났으며 cyclization 반응도 더 잘 일어났다. 이는 진공상태에서의 농축이 효소의 구조에 영향을 주었기 때문으로 보여진다.

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