Penicillium citrinum으로부터 NEO-프락토올리고당 생산을 위한

배지 최적화

박만철, 박승원, 박강준*, 김진철*, 김승욱

고려대학교 화공생명공학과, (주) 제일제당*

Optimization of production medium for the production of NEO-fructooligosccharides by Penicillium citrinum

Man Chul Park, Seung Won Park, Gang Jun Park*, Jin Chul Kim*,

Seung Wook kim

Department of Chemical and Biological Engineering, Korea University

CHEIL JEDANG Corporation*

서론

설탕을 원료로 하여 생산되는 NEO-프락토올리고당은 연황색 또는 무색의 단맛을 가진 점조성 액상을 나타내고 있으며, 설탕을 효소접촉하여 포도당과 과당이 분해 및 재결합에 의해 포도당 한 분자에 과당이 2∼4분자가 결합된 올리고당이다. 기존의 프락토올리고당과 분자식은 동일하나 1-케스토스와  니스토스의 구조식이 차이를 보이고 있다. 이러한 NEO-프락토올리고당은 아스파라거스, 귀리, 호밀, 보리등에 존재하는 것으로 발표되어 있다. NEO-프락토올리고당은 비피더스균의 증식작용 및 장내 세균의 개선, 유해균 성장 억제 작용, 난충치성, 변비 개선, 혈청 지질 개선, 장내 부패물질의 감소 등의 효능을 보이고 있다.

본 연구에서는  NEO-프락토올리고당 생산성을 향상시키기 위하여 Penicillium citrinum의 생산 배지를 최적화 하였다.

실험재료 및 방법

배양

NEO-프락토올리고당 생산 균주로는 제일제당에서 보유하고 있는 Penicillium  citrinum을 사용하였다. 종균 배양배지로는 sucrose 20% (w/v), NaNO3 0.2%    (w/v), K2HPO4 0.5% (w/v), yeast extract 2% (w/v), MgSO4·7H2O 0.1% (w/v), KCl 0.1% (w/v), FeSO4·7H2O 0.002% (w/v)를 사용하였고, 종균 배양을 위하여 5%(v/v) 포자 현탁액을 접종하였으며 종균 배양조건은 초기 pH를 6.0으로 일정하게 하였으며, 28。C의 온도와 200 rpm의 교반속도를 유지하면서 3일동안 배양하였다. 이후 5% (v/v)의 접종량으로 본 배양배지(종균 배지와 동일)에 접종하여 약 90시간 동안 배양하였다.

배지최적화

본 배양에서 배지조성을 달리하여 실험하였고, 이에 따른 NEO-프락토올리고당의 생산성을 비교함으로써 최대의 NEO-프락토올리고당을 생산 할 수 있는 배지조성을 SAS program을 이용하여 실험 통계학적방법으로 확립하였다. 사용된 배지 구성 성분들 중에서 NEO-프락토올리고당 생산에 가장 큰 영향을 미치는 factor를 선택하기 위하여 ANOVA(Analysis of Variance)를 사용하였고 이로부터 얻어진 factor들의 최적 농도를 구하기 위하여 RSM(Response Surface Methodology)을 사용하였다.

결과 및 토론

Penicillium citrinum의 성장 특성

Penicillium citrinum의 성장 특성을 파악하기 위한 실험이 진행되었다. Figure 1에서 보는 바와 같이 배양 후 50시간만에 82 g/L의 균체량을 얻었으며, 이 때 세포 내 역가 또한 가장 높았다. 하지만 세포 밖의 NEO-프락토올리고당에 대한 역가는 배양 후 10시간만에 약 180 Unit/mL에 도달하였으나 그 이후 더 이상의 증가는 없었다.

ANOVA(Analysis of Aariance)에 의한 분석

NEO-프락토올리고당의 효율적인 생산을 위하여 생산 배지를 최적화 하였다. 사용된 배지 성분들 중에서 NEO-프락토올리고당 생산에 가장 큰 영향을 미치는 factor를 선별하기 위하여 ANOVA가 사용되었다. Table 1에 ANOVA 분석에 의한 결과를 나타내었다. F 값은 실험된 범위에서의 각 factor들의 영향력을 나타내는 것으로 크면 클수록 영향이 큼을 나타내고, P 값은 실험된 factor가 효력이 없을 가능성을 나타내는 것으로 작을수록 신뢰 할 수 있다는 의미다. Table 1에서 보는 바와 같이 균체량은 가장 큰 F값과 가장 작은 P값을 가지는 sucrose와 yeast extract의 영향이 가장 큰 것으로 나타났으며, 반면에 NEO-프락토올리고당 생산에서 세포내 역가는 sucrose와 MgSO4·7H2O의 상호관계가 가장 큰 영향을 미치고, 세포외 역가는 sucrose가 가장 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 하지만 MgSO4·7H2O의 경우 실험된 범위의 농도가 작을 뿐 만 아니라, 특히 (-)에서 상대적으로 높은 세포내 역가를 나타낸다. 즉 굉장히 미량일 때 세포내 역가가 높음을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 NEO-프락토 올리고당 생산과 균체량을 고려하여 sucrose와 yeast extract의 최적 농도를 구하고자 하였다.

RSM(Response Surface Methodology)에 의한 최적 농도 결정

ANOVA 분석에서 알 수 있듯이 sucrose는 균체량에 큰 영향을 미치지만, 대부분의 높은 세포량은 (-)범위 이 때 얻어짐을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 ANOVA에서 실험된 sucrose의 농도 범위보다 낮은 범위에서 실험하였고, 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 이 결과를 토대로 RSM을 실행하였고, 균체량과 NEO-프락토올리고당 생산에 대한 각각의 다항식을 다음과 같이 얻었다.

균체량 = 112.57 - 43.42 X + 15.22 X2 +15.33 Y -13.91 Y2 -25.5 XY

세포내 역가 = 519.03 +59.27 X -35.87 X2 +17.42 Y -25.53 Y2

+ 30.4 XY

세포외 역가 = 291.33 + 11.47 X - 3.95 X2 + 2.77 Y - 2.72 Y2

- 0.25 XY

( X = sucrose. Y = yeast extract)

다항식을 통한 mesh plot을 통해 각각의 최적 농도를 구할 수 있었다. 통계학적으로 계산된 세포내 역가에 대한 최적 농도는 sucrose가 16.45%, yeast extract가 3.11% 였고, 이 때의 예상값은 567.21 Unit/g 이었다(Figure 2). 또한 세포외 역가는 최대값을 나타내는 농도가 sucrose가 17.15%, yeast extract가 2.11% 였고, 이 때의 최대값은 300.20 Unit/mL 이었다(Figure 3). 하지만 균체량의 경우는 최대값을 나타내는 농도를 구할 수 없었고, sucrose의 농도가 증가할수록 균체량은 감소하는 것으로 나타났다(Figure 4). 본 연구의 목적은 NEO-프락토올리고당의 생산을 향상시키는 것이므로, 세포내 역가가 가장 높게 나타난 sucrose 16.45%(w/v), yeast extract 3.11%(w/v)를 최적 조건으로 선택하였다. 이때의 조건에서 비록 약간의 차이는 있지만 세포외 역가 또한 최대값에 근접함을 알 수 있었다.

Table 1. The statistical analysis by ANOVA

	Cell weight		Intra- cellular activity		Extra- cellular activity
Factor	F value	P value	F value	P value	F value	P value
A	40.10	0.011	16.86	0.06	101.08	0.004
B	55.26	0.007	3.31	0.21	1.26	0.34
C	1.35	0.33	15.42	0.07	8.01	0.07
D	0.28	0.63	14.08	0.07	3.93	0.14
E	0.82	0.43	3.45	0.21	0.30	0.62
A*C	7.23	0.08	3.57	0.20	3.90	0.14
A*C	0.82	0.43	0.06	0.81	0.09	0.77
A*D	0.61	0.49	89.11	0.02	0.09	0.77
A*E	0.05	0.81	8.05	0.11	0.32	0.61
B*C	1.16	0.36	0.15	0.73	2.43	0.22
B*D	0.16	0.71	1.26	0.38	10.62	0.05
B*E	11.34	0.05	9.08	0.1	0.51	0.53
C*D	7.69	0.07	0.57	0.53	0.03	0.85
C*E	3.87	0.14	2.60	0.25	0.99	0.39
D*E	2.01	0.25	1.49	0.35	0.03	0.85

(A-Sucrose, B-Yeast extract, C- K2HPO4,  D-MgSO4, E-NaNO3)

Table 2. Experimental design and results for the determination of optimal conditions using sucrose and yeast extract

Runs	Sucrose	Yeast extract	Cell weight (g/L)	Intracellular activity (Unit/g)	Extracellular activity (Unit/mL)
1	-1	-1	213.30	369.51	264.40
2	1	-1	106.68	445.86	290.50
3	-1	1	279.46	383.98	272.30
4	1	1	70.26	581.94	297.40
5	-1.414	0	128.78	389.02	272.60
6	0	-1.414	82.33	484.26	286.80
7	1.414	0	106.64	530.25	301.30
8	0	1.414	147.86	476.33	292.00
9	0	0	107.32	530.00	295.50
10	0	0	100.40	520.51	288.00
11	0	0	118.64	505.54	284.90

Fig 1. Growth and activity profiles       Fig 2. The effect of sucrose and

of Penicillium  citrinum.         yeast extract on intracellular activity.

Fig 3. The effect of sucrose and         Fig 4. The effect of sucrose and

yeast extract on extracellular activity.         yeast extract on cell weight.

감사의 글

본 연구를 일부 지원하여 주신 유변공정연구센터 (한국과학재단 ERC)에 감사드립니다.

참고문헌

1. Sachio, H., Takenobu, Y., Norito, F., Satoru, S., Biotechnol. Lett., 22, 1465-1469, 2000.

2. Yun, J. W.,  Lee, M. G., Song, S. K.,  Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 9, 127-132, 1994.

3. Yun, J. W. Enzyme  Microb. Technol., 19, 107-117, 1996.