유전체자료분석에 있어서의 통계적 이슈

이 재 원, 박 미 라*

고려대학교 통계학과, 을지의과대학교 의예과*

Statistical Issues in Microarray Data Analysis

Jae Won Lee, Mira Park*

Department of Statistics, Korea University,

Eulji University, School of Medicine*

서론

최근 들어 국내외에서 유전체 자료(genomic data)에 관한 많은 연구가 집중적으로 이루어지고 있다. 특히 DNA microarray 기술은 수천 개의 유전자에 대한 발현양상을 동시에 관찰한 것으로 유전자의 regulation과 interaction의 이해를 돕는데 큰 기여를 할 뿐 아니라, 제약이나 임상연구에서도 매우 중요한 응용을 할 수 있다 (Eisen et al, 1998; Golub et al, 1999). 그러나 이러한 microarray data는 실험계획이나 image processing, 판별분석 등에 이르는 다양한 과정에 걸쳐 수많은 통계적 문제점들을 안고 있게 된다 (그림 1 참조). 이는 본질적으로 대규모 관측에 따른 위양성(false-positive) 발견 수의 증가와 여러 개 array slide의 동시 실험에 따른 고차원 통계량 분석의 어려움에서 기인한다(Weinstein, 1998). 인간유전체 기능연구가 성공적으로 수행되기 위해서는 이러한 data processing 및 data analysis 과정이 올바르게 제어되어야 한다.  이 가운데에서 유전체자료의 품질관리를 위한 방법으로 표준화방법 및 생명정보학적 발견에 대한 통계적 평가방법, 유전체자료분석에서의 클러스터링 방법에 관한 연구를 논의하겠다.

통계적 이슈

microarray 실험에 있어서는 중요한 측정된 유전자 발현수준에 영향을 미치는, 피할 수 없는 기술적인 변이(systematic &  instrumental variation)가 많이 있을 수 있다. 예를 들어, 두 fluorescent dye 간의 labeling efficiency의 차이나 scanning property의 차이 등에서 발생되는 이러한 변이는 실험의 결과와 해석에 지대한 영향을 미칠 수 있으므로 이를 인식하고 제거하기 위한 절차가 반드시 필요하게 되는데 이를 표준화(normalization)라고 한다(Chen et al., 1997; Newton et al., 1999). 변이를 가져올 수 있는 많은 요인들은 sample의 내적문제든 외적문제든 간에 전체적인 정규화 절차에 대한 어려움들을 나타낸다. 또한 반복적인 실험에서 상대적인 유전자 발현수준(로그비로 측정된)은 실험 조건의 차이로 인해 서로 다른 spreads를 가질 수 있다.  특히, 하나의 특정 실험에서의 비정상적인 상대적 발현 수준이 반복된 실험의 평균적 발현수준을 dominate 하지 않도록 하기 위해서 안정적인 통계 조정이 필요하게 된다. 이러한 경우에는 각 슬라이드에 대한 로그비(log-ratio)의 분포에 대한 중앙값이 0이 되도록 만들기 위해서 상수조정(constant adjustment)이 가장 많이 사용되는 방법이다. 그러나 이러한 전체적인 표준화 절차는 dye의 편차가 spot intensity나 gene spot의 위치(print-tip effect)에 의존하는 경우에는 적절치 않게 되며 intensity와 gene spot의 위치를 고려하여 표준화하는 방법이 필요하게 된다.

또한 microarray 실험에서 비싼 실험 비용으로 인하여 실험의 반복을 고려하지 않는 경우가 많다. 그러나 반복하지 않은 실험은 내적 변이의 특성을 찾아 낼 수 없는 한계를 가지고 있고 무수한 위양성(false-positive) 발견을 나타내게 된다. 이는 실제 생물학적 발견을 위해 follow-up confirmation study가 극도로 어렵거나 비현실적인 연구가 되는 결과를 초래한다. 따라서 비반복 chip 실험에서 array 실험의 비용이 낮아진다 하더라도 결국 그러한 비반복실험에 뒤따르는 수고와 총 실험비용은 더 높은 것이 될 것이다. 따라서 정밀한 반복 실험을 통하여, 일반적으로 행하여지고 있는 비반복 실험에서 확인될 수 없는 내적 변이 가능성을 살피고, 유전자 발현자료에서 반복실험이 일치성과 신뢰도가 높은 연구결과를 제공하는지에 대한 논의를 할 필요가 있다. 또한 더 나아가서 이러한 반복 array 실험을 기반으로 하여 생물정보학적 발견에 대한 통계적 검정력을 증가시키고 동시에 위양성(false-positive) 및 위음성(false-negative) 오류율을 감소시킬 필요가 있다.

현재까지는 이러한 표준화 과정이나 실험결과의 평가 등이 아예 간과되고 있거나 각 연구의 다양성을 고려하지 않은 채 연구가 진행, 분석되고 있는 경우가 흔하다. 그러나 유전체 자료의 질을 높이고 보다 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해서는 통계적 품질관리가 반드시 필요하다.

한편 생명체의 유전적 특징은 한 두 유전자에 의해서 나타나는 것이 아니고, 여러 유전자간의 관계 하에서 이해할 수 있으므로 특별히 다르게 발현된 각각의 유전자를 찾는 과정만으로는 생물체의 유전적 특징을 살펴볼 수는 없게 된다. 따라서 어떤 유전적 특징을 살피기 위해서는 유사하게 발현되는 유전자를 하나의 집단으로 모아 볼 필요가 있다. 이러한 접근 방법이 곧 클러스터링 분석방법이다(Zhang and Zhao, 2000).  Claverie(1999)는 유전체 기능연구에 있어 유전체 수준의 유전자발현자료의 해석을 다음과 같이 3단계로 정의하였다.

① differentially expressed gene의 인식

② pairwise gene expression correlation의 인식

③ gene expression 패턴- cluster의 구체화

①과 ②를 수행하기 위한 방법은 선진국에서는 접근방법이 점차로 정립되어 가고 있으나, 상대적으로 아직까지 해결해야 할 과제가 많이 남은 것은 ③의 단계인데 그 이유는 이 문제에 있어서 생물학자들에게 최적의 선택이 무엇인지가 분명치 않기 때문이다. 이 분야에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있지만 아직까지도 서로 다른 클러스터링방법을 사용함으로써 동일한 조건의 유전자발현데이터에 대해서 서로 다른 생물학적 결과들이 도출되고 있다. 클러스터링기법은 국내의 유전체 연구에서도 많이 이용되고 있으나 한정적으로 몇 방법만이 사용되고 있으며, 따라서 각 상황별로 최적의 방법을 찾는 문제에 관한 연구가 필요하다.

결론

유전체연구는 과거 sequencing을 주로 하는 구조유전체(structural genomics)의 시대를 떠나 기능유전체(functional genomics)의 시대로 접어들고 있다. 기능유전체의 시대에서는 통계학 및 전산학 등의 생물정보(bioinformatics)가 축적된 대량의 유전자정보를 효과적으로 신속히 분석하여 생물학실험을 가이드할 수 있는 적극적인 역할을 해야 하는 시대이다. 유전체 자료의 통계적 분석에 대한 수많은 방법들이 계속해서 쏟아져 나오고 있기는 하지만 각 방법들이 완전히 검증되어 있다고는 볼 수 없다. 따라서 현재 사용되고 있는 유전체 자료의 분석도구들이 검증된 통계적 방법을 제공하고 있는지에 대해 살펴볼 필요성이 있으며, 이러한 연구를 통해 보다 정선된 분석방법들을 연구자들에게 제공할 필요가 있다. 우리나라는 유전체연구사업에 있어서 후발주자로서 시행착오를 줄이고 선진국과의 격차를 최대한 빨리 해소하기 위해서는 국제간 협력연구가 적절한 방법이 될 것이다. 아울러 실제 유전체 분야의 연구에서 많은 경험을 가진 연구자들이 긴밀히 협조함으로써 통계적 방법의 개발시일을 앞당길 수 있을 것이다.

참고문헌

1. Chen, Y., Dougherty, ER., Bittner, ML.(1997). Ratio-based decisions and the   quantitative analysis of cDNA Microarray Images. Journal of Biomedical       Optics. 2(4); 364-374.

2. Claverie, JM.(1999). Computational methods for the identification of          differential and coordinated gene expression. Human Molecular Genetics.       8-10; 1821-1832.

3. Eisen, MB., Spellman, PT., Brown, PO., and Botstein, D.(1998). Clustering    analysis of display of genome-wide expression patterns. PNAS. 95;           14863-14868.

4. Golub, TR., Slonim, DK., Tamayo, P., Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov,   JP., Coller, H., Loh, ML., Downing, JR., Caligiuri, MA., Bloomfiled, CD., and   Lander, ES.(1999). Molecular classification of cancer: class discovery and      class prediction by gene expression monitoring. Sclience. 286-5439; 531-537.

5. Newton, MA., Kendziorski, CM., Richmond, CS., Blattner, FR., and Tsui,     KW.(2000). On differential variability of expression ratios: Improving          statistical inference about gene expression changes from microarray data.      Dept. of Biostat. & Med. Info. TR 139, U of Wisconsin.

6. Weinstein, JN., Myers, TG., O'Connor, PM., Friend, SH., Fornace, AJ Jr.,    Kohn, KW., Fojo, T., Bates, SE., Rubinstein, LV., Anderson, NL.,             Buolamwini, JK., van Osdol, WW., Monks, AP., Scudiero, DA., Sausville,      EA., Zaharevitz, DW., Bunow, B., Viswanadhan, VN., Johnson, GS., Wittes,    RE., and Paull, KD.(1997). An information-intensitve approach to the          molecular phamacology of cancer. Science. 275-5298; 343-349.

7. Zhang, K., and Zhao, H. (2000). Assessing reliability of gene clusters from   gene expression data. Funct Integr Genomics. 1;156-173.

<그림 1> microarray 실험과 통계적 방법