High-Performance Membrane Chromatography에 의한

Protein의 분리특성

홍 승 범·김 정 일·선 향*·장 윤 호·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

*기술표준원, 섬유과

Separation Characteristics of Protein

by High-Performance Membrane Chromatography

Seung Bum Hong, Jung Il Kim, Hyang Sun*,

Yoon Ho Chang, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Agency for Technology and Standards. MOCIE

서론

High-Performance Membrane Chromatography (HPMC)는 최근 들어 많은 연구가 진행되고 있는 크로마토그래피의 기술 중에 하나이다. 특히 액체 크로마토그래피와 membrane의 혼합공정은 생 고분자물질의 분리와 정제에서 탁월한 효과가 있다. 또한 plasmid DNA와 단백질 분리에 있어 빠른시간 안에 분리를 할 수 있다.[1] 현재 가장 효율적인 HPMC 분리 기술에서 사용하고 있는 membrane의 형태는 미세공 조직을 가진 평막(flat sheet)과 중공사막(hollow fiber), membrane stacks, radial flow cartridge로 분리되고 이들을 고정상(stationary phase)으로 사용한다. 분리의 메카니즘은 affinity interaction, ion exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase, multistage chromatography이다.[1] Membrane은 세공크기와 흡착에 의한 물질의 분리가 이루어지는 반면 기존의 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)에서는 컬럼에 충전된 흡착제와 이동상간의 확산, 입자사이의 흡착과 탈착의 메커니즘으로 분리가 되는데 상용되는 흡착제의 대부분은 다공성 입자이다.[2] 큰 흡착능력, 큰 표면적이 좋기 때문에 결과적으로 미세한 구멍이 많이 필요하다. 흡착질 분자는 흡착제 입자 밖에서 들어오고, 입자 안쪽으로 확산되어 사용할 수 있는 흡착자리를 가득 채운다. 흡착제 구조에 의존하는 확산메커니즘의 몇몇 다른 형태가 지배적이 되고 때때로 둘 또는 세 가지가 경쟁적으로 흡착한다. 그 지배적 메커니즘은 또한 흡착제와 흡착질의 조합과 온도, 농도 범위 같은 흡착조건에 의존한다. 이러한 이유 때문에 분리시간이 길어지고 높은 압력에서 분리가 된다. 그러나 HPMC에서는 흡착제의 작용과는 구별되는 얇은 막을 통해서 쉽게 물질전달이 되므로 분리시간을 단축할 수 있고 낮은 압력으로 분리가 가능하다.[3] HPMC의 주요응용 분야로는 단백질 정제와 의학분야 이다. 본 연구에서는 Monlithic Convective Interaction Media(CIM) DAEA(diethylaminoethyl) disk, QA(quaternary amine)을 사용하였다. 단백질은 이온교환 작용에 의해서 분리가 되며, DEAE와 QA는 음이온교환 disk로 사용되었다.

Protein과 Membrane의 이온교환 메카니즘

Membrane chromatography에서 가장 중요한 요소 중의 하나는 고정상으로 사용되는 membrane 지지체의 선택문제 이다. HPMC의 분리 메카니즘은 단백질 분자들과 멤브레인 표면의 활성화된 작용기(양이온 교환, 음이온 교환)사이에서 흡착과 탈착의 원리로 분리가 일어나게 된다. 효과적인 분리를 위해서는 미세공막과 작용기를 결합하는 방법을 연구하는 것이 중요하다. HPMC에서 사용되는 membrane의 제조는 두 단계로 이루어진다. 지지체를 화학적으로 활성화시키는 것과 활성화된 지지체에 리간드를 결합시키는 것이다. Matrix의 활성화 부분에 결합된 물질은 그 지지체 자체의 성질과 안정성에 의해서 결정된다. 리간드를 고정화시키는 방법은 지지체위에 직접 리간드를 결합시키는 것과 효과적으로 리간드를 결합시킬 수 있는 spacer group을 지지체에 결합시키는 것이다.[4] Membrane을 활성화시켜 리간드를 결합시키는 방법은 일반 크로마토그래피에서 사용되는 충진컬럼에서 사용되는 방법과 동일하다. 본 연구에 사용된 CIM disk는 음이온 교환 작용으로 분리가 되는데 라디칼 중합에 의해서 disk 표면에 DEAE와 QA 작용기을 결합시켜 활성화된 표면과 단백질 분자 사이에서 분리가 일어나게 된다. HPMC에서 얇은 이온 교환 membrane(3mm)이 단백질 분자를 흡착 분리하는 메카니즘은 이온 교환을 할 수 있는 음이온 교환 리간드를 가지고 있는 ion-exchange membrane을 사용하여 분리하는 방법이다.

CIM disk의 음이온 교환 작용기와 단백질(Myoglobin, Con- albumin, Soybean trypsin inhibitor)분자들이 이동상조성에서 해리가 되면서 단백질 분자들은 음이온의 성질을 가지게 되고, disk의 활성화된 작용기 (DEAE, QA)는 양이온의 극성을 가지게 되면서 분리가 일어나게 된다. 이때 단백질 분자의 등점점(isoelectric point)와 buffer인 염의 농도가 중요한 분리 메카니즘의 인자로 작용하게 된다. 그래서 구배용매 조성(gradient elution)으로 최적의 분리 조건을 찾는 것이다.

최근 HPMC의 응용 범위는 plasmid DNA, peptides, oligo- nucleotides와 polynucleotides, 분자들의 분리에 응용되고 있다. 현재 사용되고 있는 막의 분리기능은 대부분 물리적 기능이다. 따라서 그 분리 정도가 낮다. 일반적인 화학 분리 공정에서 물리적인 분리 방법은 분리 인자 (separation factor)가 2-4정도인데 반해 화학적 분리법은 10-30정도이며 생물학적인 분리 방법은 100-수천에 이른다. 따라서 분리도를 높이기 위해서는 막에 화학이나 생물학적인 분리가능 방법을 도입하는 것이 필요하게 되었다. 그래서 현재 응용되고 있는 것이 membrane chromatography 이다.

또한 기존의 컬럼 크로마토그래피와의 호환성이 좋아서 효율적으로 단백질 분석에 응용될 수 있다.

실험

1. 시약 및 기기

본 실험에 사용된 시약은 Myoglobin, Conalbumin, Soybean trypsin inhibitor은 Sigma에서 구입하였고, 이동상은 Tris-HCl(pH7.4)과 NaCl을 사용하였다. 고정상으로는 직경이 16mm, 두께가 3mm인 Monlithic Convective Interaction Media(CIM) DAEA disk와 QA을  BIA Separation Slovenia에서 구입하여 사용하였다. HPLC는 Waters사의 600E 펌프(multisolvent delivery system), 490 UV-visible tunable wavelength absorbance, 280nm, Rheodyne 주입기(20□ sample loop), 데이터 저장 시스템은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)를 사용하였다.

2. 방법

본 실험에서는 CIM DEAE(diethylaminoethyl) disk, QA(quaternary amine)을 고정상으로 하고 이동상은 buffer A(20mM Tris-HCI, pH 7.4)와 buffer B(buffer A + 1M NaCl)를 사용하였다. Injection volume은 20□, 유속은 4 □/min이며, UV wavelength 280nm 실온에서 실험하였다. Myoglobin 0.5mg, Conalbumin 1mg, Soybean Trypsin Inhibitor 1.5mg을 buffer A 1ml 에 녹여서 사용하였다.

결과 및 고찰

Fig. 1에서는 세 가지 proteins (Myoglobin, Conalbumin, Soybean- trypsin inhibitor)를 구배용매 조성법 (gradient elution)을 사용하여 분리하였다. 분리 메카니즘은 proteins와 Monlithic Convective Interaction Media(CIM) DAEA disk, QA disk 사이의 이온교환으로 분리가 일어난다. 크로마토그램에서 보는 것과 같이 첫 peak는 Myoglobin, 다음 두 peak는 차례대로 Conalbumin과 Soybean trypsin inhibitor 이다. 여러 번의 solvent programming으로 최적의 분리조건을 잡았으나 Conalbumin과 Soybean trypsin inhibitor은 분리도가 좋지 않았다. Fig. 2에서는 CIM disk를 QA(quaternary amine)으로 실험을 한 결과이다. Fig. 1과 비교해 볼 때 체류시간을 단축할 수 있었고 분리도 향상되었다. Fig 3.에서는 buffer 안의 NaCl 함량에 따른 세 가지 proteins 각각에 대해서 체류시간을 나타내었다. NaCl의 함량이 증가할수록 Myoglobin의 영향을 거의 없었으며, Conalbumin과 Soybean trypsin inhibitor은 체류시간이 빨라지는 것을 알 수 있었다. 음이온 교환 membrane 크로마토그래피에서는 등점점(Isoelectric point) 차이에 의해서 단백질을 분리하는데, 단백질이 음이온으로 해리가 되면서 disk의 양이온 작용기와의 흡착 메카니즘으로 분리가 일어나게 된다. 이때 NaCl의 농도가 높아지게 되면 이온교환이 빠르게 일어나면서 체류시간이 빨라지게 되는 것이다. 분석시간은 1-2min사이고 일정용매 조성법 보다 구배용매 조성법으로 분리가 되며 사용되는 음이온 교환 monlithic column의 disk는 QA나 DEAE가 별 차이가 없이 분리가 되었다.

알림

본 연구는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 수행하였으며 기술표준원 산업기반 연구개발의 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. Xianfang Zeng, Eli Ruckenstein, Biotechnol. Prog., 15,1003(1999)

2. 노경호 □액체 크로마토그래피의 원리와 응용□, 인하대학교 출판부(1999)

3. Ales Podgornik, Tatiana Tennikova, Anal. Chem., 71,2986(1999)

4. Ales Podgornik, Milos Barut, Janez Jancer, Journal of Chromatogra-     phy A, 848,51(1999)

Fig. 1 Gradient separation of Myoglobin, Conalbumin, and Soy bean trypsin inhibitor using CIM DEAE.

(mobile phase ; buffer A of 20mM Tris-HCl, buffer B of 1M            NaCl in buffer A, 4ml/min flow rate, 280nm)

Fig. 2 Gradient separation of Myoglobin, Conalbumin, and Soy bean trypsin inhibitor using CIM QA.

Fig. 3 Effect of the content of NaCl on the retention times