젖산의 반응추출 및 젖산 발효 균주에 대한 추출용매의 독성

홍 연 기, 이 동 우, 한 동 훈*, 이 평 천, 홍 원 희, 장 호 남

한국과학기술원 화학공학과

*LG 환경기술연구원

Reactive Extraction of Lactic Acid and Toxicity of Organic Solvents on Fermentation Microbe of Lactic Aacid

Yeon Ki Hong, Dong Woo Lee, Dong Hoon Han*, Pyung Cheon Lee,

Won Hi Hong, Ho Nam Chang

Department of Chemical Engineering

Korea Advanced Institute of Science and Technology

*LG Institute of Environment, Safety and Health

서론

젖산은 식품산업을 비롯하여 최근에 들어 생분해성 고분자의 원료 물질로 주목 받고 있는 카르복실산 중의 하나이다. 기존의 경우 주로 화학적 합성법에 의해 생산되어 왔으나 근래에는 발효에 의한 생산이 이루어졌다. 발효에 의한 방법은 광학적으로 순수한 L(+) 젖산을 생산할 수 있다는 장점을 가진다 [1].

발효공정의 수율 향상과 공정자체의 경제성을 높이기 위해서는 발효공정상의 생성물 저해를 막으면서 분리단계를 단축시킬 필요가 있다.

아민계 추출제를 이용한 용매 추출법은 발효액으로부터 젖산을 정제하는 목적 뿐 아니라 발효조와 연결되어 생성물 저해 방지를 통한 발효공정의 수율향상을 가져올 수 있는 방법이다. 이때 추출용매의 선정은 젖산에 대한 높은 분배계수를 가지는 것 외에도 발효균주에 대한 독성이 고려되어야 한다. 아민계 추출제의 경우 여러 카르복실산에 대해 높은 추출효율을 가진다고 보고되어 왔을 뿐 아니라 다른 추출제에 비해 상대적으로 경제적이며 역추출 및 추출제 회수가 용이 한 것으로 알려져 있다 [2, 3].

본 연구에서는 다양한 희석제와 삼차아민의 조합의 젖산에 대한 분배계수를 측정하고 젖산의 발효 균주인 Lactobacillus rhamnosus에 대한 독성을 조사하였다.

실험

(1)시약

가. 아민 및 젖산

본실험에서 사용한 아민은 Aldrich사의 트리프로필아민(TPA), 트리부틸아민(TBA), 트리펜틸아민(TPeA), 그리고 ACROS사의 트리옥틸아민(TOA)를 이다. 이들 아민은 99.9%이상의 순도를 가지며 실험시 정제하지 않고 그대로 사용하였다.

L(+) 젖산은 ACROS로부터 공급받은 20 %(w/w)의 수용액을 적절이 희석하여 사용하였다.

나. 균주 및 배지

본연구에 사용된 균주는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 공급받은 Lactobacillus Rhamnosus (ATCC 10863)이다. 균주 배양을 위한 배지는 DIFCO사의 MRS 배지를 사용하였으며 배양과정은 Kwon et al. (2000)의 방법을 따랐다 [4].

(2)실험 방법 및 분석

가. 젖산의 회분식 추출

숙신산 추출을 위해 준비된 농도의 숙신산 10ml와 아민을 포함한 유기용매 10ml를 25ml의 바이얼에 넣고 정해진 온도를 유지하며 1000 rpm으로 2시간동안 추출하였다. 그리고 추출후 원심분리기에서 4000 rpm에서 15분간 상분리를 실시하였다. 젖산의 농도는 0.1 N NaOH를 사용하여 적정하였으며 지시약으로는 페놀프탈레인을 사용하였다..

나. 균주에 대한 독성 실험

Precultured cell을 멸균된 물로 한차례 세척한후 튜브 culure에 10%(v/v)의 접종비로 접종하였다. 그 후 유기용매를 튜브 culure에 10%(v/v)의 비율로 첨가하였다. 교반속도는 150 rpm이었으며 배양 온도는 42oC로 하였다.

세포 성장은 Spectrophotometer (Ultrospec 3000, Pharmacia, Cambridge, UK)를 이용하여 620 nm의 파장을 가지는 가시광선을 이용한 광학밀도를 이용하여 측정하였다.

결과 및 토론

(1) 다양한 유기상에서의 젖산의 회분식 반응추출

Fig. 1에서는 TOA와 혼합된 다양한 희석제에 대하여 수용상의 젖산의 농도에 따른 분배계수를 나타내었다. 이들 유기상에 대한 젖산의 용해도는 다음과 같이 나누어 해석할 수 있다.

[eqn: p Lactic~ acid+q bar Amine ~ <->~bar {Lactic~ acid_p CDOT Amine_q }]	(1)

[eqn: Lactic ~acid~<-> bar {Lactic ~acid}]	(2)

우선, 식 (1)에서 처럼 3차 아민과 반응복합체를 형성한 젖산의 용해도는 전체 젖산의 용해도에 큰 영향을 미치지 못한다. 왜냐하면 본 연구에서 사용된 희석제의 경우 이들 젖산-아민 복합체에 대한 용해도가 충분히 크기 때문이다. 두 번째로 유기상에 혼합된 희석제에 의한 물리적 추출이다. 희석제의 극성이 증가할수록 이들이 분배계수에 미치는 영향이 커진다. 물리적 추출에 의한 분배계수는 Table 1에 나타나 있다. Fig. 1에서는 TBP를 희석제로 사용하였을 경우 분배계수가 다른 희석제에 비해 크게 나타났지만 Table 1에서 보듯이 물에 대한 용해도가 커서 실제 발효조에 추출기가 복합된 추출적 발효에는 적합하지 않은 것으로 보인다.

(2) 삼차 아민 및 희석제의 균주에 대한 독성

삼차 아민 및 희석제의 Lactobacillus rhamnosus에 대한 독성실험 결과를 Table 2에 나타내었다. Table에서 1-octanol, 1-decanol, kerosene이 독성이 적은 것으로 나타났다. 일반적으로 유기용매의 균주에 대한 독성은 유기용매 분자의 사슬길이가 증가할수록 줄어드는 것으로 알려져 있다. TBP는 젖산에 대한 높은 분배계수를 가짐에도 불구하고 Lactobacillus rhamnosus에 대한 독성이 커서 추출적 발효에 적합하지 않다.

3차 아민의 경우 실험에 사용된 3차 아민 모두 독성이 강한 것으로 나타났다. 마찬가지의 결과가 Choudhury et al (1998)에 의해 보고된 바 있다. 그들은 세포성장의 방해가 추출제의 용해 가능한 부분에 의해 이루어지는 것으로 추측하였다 [5]. 그러나 긴사슬 아민의 경우 짧은 사슬아민에 비해 다소 독성이 줄어드는 것으로 나타났는데 이는 아민 사슬길이가 길어질수록 물에 대한 용해도가 낮아지는 것으로 설명할 수 있다.

Table 3에서는 TOA/1-octanol, TOA/1-decanol의 농도 변화에 따른 독성 실험 결과를 나타내었다. TOA자체는 Lactobacillus rhamnosus에 대한 독성이 높았지만 1-octanol이나 1-decanol과 같이 독성이 적은 희석제와 혼합할 경우 균주에 대한 독성이 낮은 것을 알 수 있다. 이들 유기상은 Rhizopus arrhizus와 같은 젖산 생산 균주에 대해서도 독성이 낮은 것으로 보고 된 적이 있다 [6].

결론적으로 TOA/1-octanol, TOA/1-decanol 조합이 추출능과 균주에 대한 독성 측면에서 봤을 때 추출적 발효에 적합한 것을 알 수 있다.

감사

본 연구는 초정밀생물분리기술연구센터(BSEP)의 지원으로 수행되었습니다. 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Hong, Y.K. and Hong, W.H. Biotech. Techn., 13, 915 (1999).

2. Hong, Y.K. and Hong, W.H. Bioproc. Eng. 22, 281 (2000).

3. Hong, Y.K., Hong, W.H., and Chang, H. N. Biotech. Lett., 22, 871 (2000).

4. Kwon, S.H., Lee, P.C., Lee, E.G., Chang, Y.K., and Chang, H.N., Enzyme Microb. Techn., 26, 209 (2000).

5. Choudhury, B., Basha, A., and Swaminathan, T. J. Chem. Techn. Biotech., 72, 111 (1998).

6. Martak, J., Sabolova, E., Schlosser, S., Rosenberg, M., and Kirstofikova, L. Biotech. Techn., 11, 75 (1997).

Table 1. Distribution coefficients and water

solubilities of various active diluents

Active diluents	Distribution Coefficients	Water Concentration (mol/L)
1-Chlorobutane	no extraction	0.17
Chloroform	no extraction	0.21
MIBK	0.01	1.51
1-Decanol	0.01	2.90
1-Octanol	0.15	3.85
Tributylphosphate	0.71	5.74

Fig. 1. Equilibrium curve of lactic acid	with 0.6 mol/L TOA/various active	diluents

Table 2. Toxicity measurements of tertiary Table 3. Toxicity measurements of  amine/active diluents	TOA/1-octanol and TOA/1-decanol

Organic phase	Concentration (mol/kg)	Final (OD620)
TOA/1-octanol	0.25	3.2
	0.50	9.4
	0.75	11.4
TOA/1-decanol	0.25	12.8
	0.50	15.1
	0.75	10.8

Tertiary amines	Initial (OD620)	Final (OD620)
TPA	1.10	1.31
TBA	1.01	1.20
TPeA	0.99	2.07
TOA	1.02	2.13
Active diluents	Initial (OD620)	Final (OD620)
Kerosene	1.00	14.3
1-Octanol	1.02	15.0
1-Decanol	0.94	13.1
n-Heptane	1.00	2.62
n-Hexane	1.01	3.27
1-Chlorobutane	0.99	1.83
MIBK	1.00	1.04
Tributylphosphate	1.01	2.35

* Control : initial (1.00), final (15.88)