Hyperbranched Dendritic 고분자를 이용한 단백질의 Monolayer와        Microarray 개발

홍 미영, 윤 현철, 김 학성

한국 과학기술원 생물 과학과

Development of Monolayer and Microarray of Proteins

using Hyperbranched Dendritic Polymers

Mi-Young Hong, Hyun C. Yoon, Hak-Sung Kim

Department of Biological Sciences,  KAIST

서론

Protein Chip은  수 십에서 수 백 종류의 서로 다른 protein이나 ligand 등을  고체(금속, 유리등)표면에 microarray시키고 이것들과 특이하게 상호 작용하는 생체분자의 존재, 또는 기능 및 역할을 여러 가지 분석방법 (형광 분석기, SPR(Surface Plasmon Resonance), 질량분석기 등)을 이용하여 대량(High Throughput)으로 신속하게 분석하는 장치이다.

Protein Chip을 개발하는데 우선적으로 요구되는 사항은 생체분자 인식부위(Binding 또는 interacting region)가 보존되면서, 균일하고 안정한 생체분자의 monolayer를 고체 표면에 형성시키는 것이다. 이때 생체분자사이에 steric hinderance가 발생하지 않도록 생체분자의 밀도를 조절하는 방법도 요구된다. 다음으로, chip표면에 수 십에서 수 백 종류에 이르는 생체분자를 간편하게 patterning하여 microarray 형태로 집적시킬 수 있는 기술이 필요하며 이는 충분한 민감도(Sensitivity)와 분해능(Resolution)을 갖는 chip을 개발하기 위해 필수적으로 요구된다.

따라서 세계의 많은 대학, 연구소 및 기업에서는 protein 이나 ligand의 배향성(orientation)을 분자수준에서 조절하여 생체분자 인식부위가 보존되고, 비특이적인 protein이나 ligand의 흡착은 최소화 하면서 microarray를 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위해 다음과 같이 집중연구를 수행하고 있다

먼저 미국 Harvard 대학의 Whitesides 교수 등은 alkanthiol 분자들을 이용한 자기조립막(Self-assembled monolayer)과 □-contact printing을 이용한 마이크로패터닝을 연구하여 생체분자의 monolayer를 만드는 방법을 제안하였다.

다음으로 avidin과 biotin의 강한 상호작용을 이용하여 생체분자의 monolayer를 고체표면에 형성하는 방법에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 미국 New Mexico 대학의 Lopez 박사 그룹은 avidin-biotin 상호작용을 이용하여 얻어진 단백질 monolayer의 물리 화학적 특성을 형광 분석기로 분석한 결과를 보고하였다. 최근에 스위스 ETH의 Vogel 박사 그룹은 바이오틴화한 thiol분자로 자기조립단분자막을 제조한 다음 Streptavidin을 결합시키고 여기에 biotin으로 수식된 G protein-coupled receptor를 반응시켜 receptor의 monolayer를 성공적으로 제조하였으며 receptor의 분자인식 반응이 효율적으로 진행되도록 receptor의 배향성을 유지하는 방법을 보고 하였다.

서로 다른 생체분자를 Chip표면에 microarray시키는 기술로써는 기존에 전자공학 분야에서 사용되는 lithography방법은 제조하는데 많은 비용이 들고 생체분자에 적용하기는 어려운 점이 많다. 최근에 미국 Harvard 대학의 Whitesides 박사 그룹에서는 수 십 um 간격으로 생체분자를 patterning하여 microarray를 제조할 수 있는 microcontact printing 방법을 개발하였다. 미국의 Argon 연구소에서는 러시아 과학원과 공동으로 polyacrylamide 표면에 항체를 array 시켜 면역 진단용 Protein Chip을 제안하였고, Max-Planck 연구소에서는 DNA microarray 기술과 비슷한 형태로 단백질의 microarray를 제조하는 방법을 개발하였다.

본 연구실에서는 독특한 물리 화학적 성질을 갖는 고분자물질인 Dendrimer를 이용하여 효율적으로 단백질의 monolayer 및 multilayer의 형성에 대한 연구를 진행하였다. 이를 바탕으로 최근에는 고분자 물질인 Dendrimer를 여러 ligand로 수식화하고 이를 이용하여 단백질이나 효소의  monolayer를 제작하는 기술을 보고하였다. 본 논문에서는 hyperbranched dendritic polymer인 Dendrimer를 이용하여 단백질의 monolayer를 제작하고, microcontact printing 방법으로 단백질의 microarray를 제작한 결과에 대해 설명하고자 한다.

결과 및 고찰

Dendrimer를 이용한 단백질의 monolayer 제작

금이 증착된 chip 표면에 alkanthiol 분자를 이용하여 자기조립박막(SAM)을 제조한 다음 SAM 말단반응기를 활성화하여 dendrimer monolayer를 공유 결합시켰다. 본 연구에서는 앞의 dendrimer monolayer에 단백질이나 효소의 monolayer를 형성하였다. 그림 1에서 보듯이 Biotin과 Avidin을 이용하여 단백질의 monolayer를 제작하고 이를 생체분자 인식 반응에 사용할 수 있는 기술도 확립하였다. 단백질의 monolayer 형성을 전기화학적으로 확인하였으며 (그림 2A), SPR을 이용하여 인식결합에 의해 고정화된 단백질량을 정량적으로 분석하였다(그림 2B). 더불어 형광물질로 수식된 Avidin을 이용하여 형광 현미경으로 분석한 결과 단백질의 monolayer가 균일하게 형성된 형광이미지를 얻었다 (그림 2C).

Dendrimer를 이용한 단백질의 microarray 제작

금이 증착된 chip 표면에 SAM을 형성한 다음 microcontact printing 방법을 이용하여 dendrimer의 micropatterning을 수행하였으며, 궁극적으로 수 □크기의 높은 해상도를 나타내는 단백질의 microarray를 제조하였다 (그림 3).

그림 1. Schematic figure of avidin monolayer prepared on gold electrode surface based on the avidin-biotin interaction

그림 2. Experimental validation of avidin monolayer formation at the biotinylated dendrimer monolayer with a variety of analytical methods: electrochemical detection (그림 2A), quantitative analysis using SPR principle (그림 2B), and fluorescence microscopic imaging (그림 2C)

그림 3.  Fluorescence images of microarrayed proteins

참고문헌

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