생물여과반응기 시스템에서 질산화 미생물의 FLUORESCENT

IN SITU HYBRIDIZATION(FISH)분석

한동우, 김동진

한림대학교 환경학과

FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION(FISH) ANALYSIS OF NITRIFYING BACTERIA IN BIOLOGICAL AERATED FILTER SYSTEM

Dong-Woo Han and Dong-Jin Kim

Department of Environmental Science, Hallym University

서론

생물학적 질산화 공정에 이은 탈질화 공정은 폐수 내 암모니아 제거에 있어 매우 중요하다. 이는 어류 및 수생 생물에 독성을 지니며 용존 산소를 소비시키는 암모니움 염의 수계로 유입을 방지할 뿐만 아니라 부영양화를 억제시키는 주요 전처리 공정이다. 일반적으로 무기독립영양 미생물에 의한 질산화는 계통발생학적으로 상이한 미생물 그룹인 ammonia oxidizer와 nitrite oxidizer에 의해 2단계 반응으로 진행된다[1]. 그러나 질산화 미생물은 느린 성장 속도와 독성 충격, 온도, pH 등 환경적 변동 요소에 매우 민감하기 때문에 폐수처리 시설에서 안정된 질산화를 이루는데 종종 실패해 왔다. 활성슬러지나 살수여상의 생물막 내 질산화 미생물의 생물학적 특성과 생태를 정확히 이해하는 것이 향상된 공정 수행과 조절에 있어 필수적이다. 이러한 질산화 생물막 내 미생물 군집의 특성을 알기 위해 수행되어진 기존의 배양 의존적인 MPN, 또는 selective plating과 같은 방법은 많은 시간이 소요되며 질산화 및 질산화 미생물의 정확한 위치를 알기에는 많은 제약이 있었다[2]. 또한 미생물의 배지에 대한 선택성과 기질 경쟁 등에 의해 활성슬러지의 경우 계수된 총 미생물 중 단지 1∼15 % 정도만이 배양이 가능하였다. 이러한 이유로 Nitrosomonas 속의 미생물들이 가장 일반적으로 분리되어지고 잘 연구된 ammonia oxidizer로 알려졌으며 nitrite oxidizer로 가장 잘 연구되어진 Nitrobacter의 경우도 유사하였다[2].

16S rRNA gene(rDNA) sequence 비교 분석에 의하면 Nitrosomonas와 Nitrosospira 속(genera)을 포함하는 ammonia oxidizer는 Proteobacteria의 □ 아강(subclss) 내 미생물 그룹에 속한다. 또한 오랫동안 민물환경에서 분리된 모든 nitrite oxidizer들은 Proteobacteria의 □ 아강 내 Nitrobacter 속을 포함한다고 여겨왔다. 그러나 최근 모스크바의 부식된 철관에서 분리된  Nitrospira 속의Nitrospira moscoviensis와 Nitrospira marina 종이 nitrite oxidizer로써 주요 역할을 수행하는 것으로 밝혀지고 있다[2]. 이러한 rRNA gene(rDNA) sequence 비교 분석을 바탕으로 한 최근의 rRNA-targeted oligonucleotide probe을 통한 fluorescent in situ hybridization(FISH) 기법의 발전은 자연 환경 및 폐수처리장에 존재하는 미생물 군집의 구조 분석 및 정량화 그리고 미생물 동정에 있어 배양에 따른 오차 없이 빠르고 믿을만한 정보를 제공하여주었다[1,2].

본 연구에서는 화학무기독립영양(chemolithoautotrophic) 질산화 생물여과반응기 시스템(Biological aerated filter system;BAF)에 존재하는 질산화 미생물에 대하여 알아보았다. 이를 위해 ammonia oxidizer인 nitrosomonas spp.에 선택적인 probe NSM156과 nitrite oxidizer인 Nitrospira spp.에 선택적인 probe NSR1156의 FISH와 confocal laser scanning microscopy(CLSM) 관찰을 수행하였다.

재료 및 방법

(ⅰ) In situ hybridization

실험에 사용된 oligonucleotide probe들과 이들의 sequence, specificity 그리고  hybridization condition을 Table 1에 나타내었다. 이 probe들은 FITC, CY3 그리고 CY5로 형광 label하여 합성하였다. 선택적 질산화 생물여과 반응기에서 분리한 미생물은 고정(fixation)과 탈수화과정을  거친 후 gelatin-coated 현미경 슬라이드에 부착시킨 뒤 밤새 공기 건조시켜주었다. 위와 같은 방법으로 전 처리된 시료는 hybridization buffer(0.9M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.01% SDS, formamide; Table 1)와 probe로 46℃에서 90분 동안 반응시켜 주었다. 연속적으로 washing buffer(20 mM Tris-HCl, 0.01% SDS, NaCl; Table 1)에서 48℃, 10분 동안 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 시료를 증류수로 가볍게 헹구어 공기 건조시킨 후 25 ul의 mounting medium으로 처리하여 CLSM으로 관찰하였다.

(ⅱ) Microscopy

In situ hybridization이 끝난 미생물의 관찰은 Ar ion laser (488nm)와 HeNe lasers(543 nm, 633nm)가 장착된 MSR1024(Bio-Rad, U.K.) confocal laser scanning microscopy(CLSM)를 사용하여 관찰하였다. 미생물의 내부 구조는 transmission electron microscopy(TEM)로 관찰하였다.

Table. Oligonucleotide probes

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Probe          Specificity               Probe sequence (5'-3') % FAa   NaCl(mM)b  -------------------------------------------------------------------------------------

EUB338    Bacteria                                       GCTGCCTCCCGTAGGAGT     20        225

ALF1b     □Subclass of the class Proteobacteria, several  CGTTCGYTCTGAGCCAG      20        225

members of the  subclass of Proteobacteria,

genus Nitrospira, most spirochetes

BET42a    □ Subclass of Proteobacteria                  GCCTTCCCACTTCGTTT       35        80

NSM156    Nitrosomonas spp.                            TATTAGCACATCTTTCGAT    5        636

NSR1156   Freshwater Nitrospira spp.                     CCCGTTCTCCTGGGCAGT     30        112

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a Percentage formamide in the hybridization buffer.

b Millimolar concentration of sodium chloride in the washing buffer.

결과 및 토론

생물막 여과반응기 시스템 내 질산화 미생물의 분포를 알아보기 위하여 현미경 상에서 총 미생물이 차지하는 넓이와 probe로 염색된 넓이의 비를 알아보았으며 이는 differential interference contrast(DIC) 이미지와 CLSM projection 이미지로부터 구하였다.

Fig. 1. In situ hybridization of nitrifying bacteria in Biological aerated filter system. (A         and B) composite DIC image(A) and CSLM projection image after hybridization         with CY-5 labeled probe EUB338(red)(B) of the entire bacterial aggregates. (C         and D) In situ hybridization with CY-3 labeled probe ALF1b(blue)(C) and             CY-5 labeled BET42a(orange)(D)

그림 1에 (A)는 미생물 aggregates의 DIC 이미지로 조밀한 미생물 clusters, 거칠고 불규칙한 표면 그리고 미생물이 없는 빈 공간 등을 나타내고 있다. (B)는 (A)의 미생물 중 probe EUB로 염색된 CLSM projection 이미지를 보여준다. 대부분의 미생물들이 probe EUB로 염색된 것을 알 수 있으며 이는 cell들이 FISH 관찰을 위한 충분한 ribosomal RNA을 함유하고 있음을 증명하였다. (C)와 (D)는 probe ALF1b와 BET42a의 FISH 사진으로 반응기 내 대부분의 미생물 군집이 ammonia oxidizer와 nitrite oxidizer를 포함하는 Proteobacteria의 □ 아강 및 □아강으로 구성되어 있음을 보여준다.

Ammonia oxidizer인 Nitrosomonas spp.에 선택적 probe NSM156과 nitirte oxidizer인 Nitrospira spp.에 선택적인 probe NSR1156의 CLSM projection 이미지를 그림 2의 (A)와 (B)에 나타내었다. NSM156-positive cell들은 구형의 microcolonies를 형성하였으며 aggregates 전역에서 관찰되었다. NSR1156-positive cell들은 NSM1156으로 염색된 cell들에 비해 적은 수가 관찰되었으며 aggregate에서 부분적으로 나타났다. Nitrite oxidizer가 ammonia oxidizer에 비해 숫적으로 적게 나타난 것은 실험에 사용한 미생물들이 오랜 기간 NH4+에서 NO2-까지만 산화되도록 운전된 선택적 생물여과 반응기에서 자라 nitrite oxidizer들이 저해를 받았기 때문인 것으로 생각된다[3]. 기존의 연구에 의하면 자연 환경과 비슷한 낮은 NH4+농도(반응기의 유입 30 cm 높이에서 40 uM)로 운전된 질산화 유동상 반응기에서 숫적으로 우점종을 이루는 ammonia와 nitrite oxidizer는 Nitrosospira spp.와 Nitrospira spp.으로 나타났으며 Nitrosomonas spp. 및 Nitrobacter spp.는 FISH에 의해 관찰되지 않았다[2]. 이와 비교해 본 연구에서 ammonia oxidizer로 Nitrosomonas spp.이 관찰된 것은 실험에 사용한 반응기의 상대적으로 높은(27.7 mM) 유입 NH4+ 농도 때문인 것으로 사료된다. FISH를 이용하여 질산화 미생물을 동정한 기존의 연구 결과 중 두 편의 논문에서 생물막 반응기 내 Nitrobacter spp.가 관찰된 것을 제외하고는 대부분  Nitrobacter spp.가 관찰되지 않았다[2]. 본 연구에서도 Nitrospira spp.가 nitrite oxidizer로 관찰되었다. 그러나 질산화 미생물의 정확한 동정을 위해서는 각각의 미생물에 선택적인 다양한 probe의 FISH 분석이 수행되어야 할 것이다.

간균 형태의 미생물 TEM 사진을 그림 2-(C)에 나타내었다. 미생물의 peripheral cytoplasm 내 조밀한 여러 겹의 intracytoplasmic membranes(ICM)이 배열되어 있는데 이는 Wolf 등에 의해 형태학적으로 밝혀진 Nitrosomonas spp.와 일치하였다.

Fig. 2. In situ hybridization(A and B) and  transmission electron micrograph(C) of             nitrifying bacteria in biological aerated filter system. (A and B) CSLM projection        image after hybridization with FITC labeled probe NSM156(blue)(A) and CY-3         labeled probe NSR1156(red)(B)

서로 다른 종의 ammonia oxidizers와 nitrite oxidizers는 in situ 상태에서 그들만의 독특한 성장 속도 및 암모니아와 아질산의 산화 속도, 기질과 산소에 대한 친화성을 가지며 환경변동에 따른 민감성에도 많은 차이점을 보인다. 그러므로 숫적으로 우점종을 이루는 질산화 미생물들의 동정과 분리에 있어 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe와 함께 in situ hybridization 기법 및 CLSM의 적용은 질산화 공정에 관여하는 미생물들의 특성을 더 잘 이해할 수 있게 하며 질산화 폐수처리장의 모델링, 설계 그리고 운전의 향상에 도움을 줄 것이다.

참고문헌

1. Wagner, M., G. Rath, H.-P. Koops, J. Flood, and R. Amann, In situ           analysis of nitrifying bacteria in sewage treatment plants. Water Sci. Tech.     34, 237-244(1996).

2. Schramm, A., D. de Beer, M. Wagner, and R. Amann, Identification and       activity in situ of Nitrosospira and Nitrospira spp. as dominant              populations in a nitrifying fluidized bed reactor. Appl. Environ. Microbiol.     64, 3480-3485(1998).

3. Joo, S.H., D.J. Kim, I.K. Yoo, K. Park and G.C. Cha, Partial Nitrification in     an Uflow Biological Aerated Filter by Oxygen Limitation, Biotechnol. Lett.     22, 937-940(2000).