부분 탈아세틸화 키토산의 활성탄 칼럼에 의한 효소가수분해물의

효과적 분리

이중희, 김선영, 김 광

동아대학교 재료금속화학공학부 화학공학과

Effective Separation of Enzymatic Hydrolysates of Partially Deacetylated Chitosan by Charcoal Chromatography

Jung-Hee Lee, Sun-Young Kim, Kwang Kim

Division of metallurgical and Chemical Engineering, Dong-a University

서론

키틴은 N-아세틸-D-글루코사민 여러 개가 □-1.4-결합한 천연고분자로서 그의 올리고머는 N-아세틸키토올리고당이다. 또한 키토산은 D-글루코사민이 □-1.4 결합한 것으로서 그의 올리고머는 키토올리고당이다. 키틴, 키토산의 이용연구는 그의 대상이 다당과 그의 유도체가 한계였다. 그러나 최근에는 바이오매스로서 천연소재를 이용한 올리고당이용연구가 주목되어 항암성과 항균성 등의 생리활성에 유용한 것으로 밝혀지고 있다. 이들 올리고당은 다당을 산에 의해서 부분적으로 가수분해 된 혼합물을 각종 칼럼에서 분리함으로서 제조하고 있다. 그러나 산분해법[1]은 당쇄의 절단이 임의로 일어남으로 단당과 여러 가지 중합도를 갖는 올리고당이 동시에 생성됨으로 분획조작이 복잡하게 된다. 그리고 각 올리고당 성분의 수율이 낮아진다. 최근에는 산분해법보다는 세균을 이용한  N-아세틸-D-글루코사민 2당의 제법, 키토산화제를 이용한 D-글루코사민 2∼5당의 제법, 키티나아제 또는 라이소자임의 당전위반응을 이용한 N-아세틸-D-글루코사민의 6∼7당의 제법이 개발되었다.[2-6] 이들의 제법은 올리고당의 혼합물로서 각 당별 분리 추출된 것은 아니다.

본 연구에서는 기질 특이성이 탈아세틸화도에 의존되어 변화되므로 효소가수분해물의 생성올리고당도 목적에 맞게 생산될 수 있도록 부분적으로 탈아세틸화한 키토산의 여러 기질로부터 효소 반응시킴으로서, N-아세틸-D-글루코사민 올리고당; (GlcNAc)1-8 의 1당부터 8당까지의 분리추출을 활성탄 크로마토그래피 칼럼에 의하여 시도하였다.

실험재료 및 실험방법

1.미생물의 배양 및 효소 생성

Serratia marcescens 균주는 1%(w/v) yeast extract, 2% peptone, 2% glucose 액체 배지에 pH 7.0으로 30℃에서 24시간 배양하였다. 키티나아제와 키토바이아제의 조효소 용액의 생성은 회분 배양하였으며, 15g/L 키틴 (practical grade of Sigma Chemical Co. Ltd.), 0.5g/L yeast extract, 1.0g/L (NH4)2SO4, 0.3g/L MgSO4·7H2O, 그리고 1.36g/L KH2PO4의 배지에서 pH는 멸균하기 전에 1M-NaOH로서 8.5∼9.0으로 조절하였다.

2.수용성 기질제조 (60∼80% 탈아세틸화 키토산의 균일 및 불균일 반응 조건의 2종류 제조) 및 효소 가수분해 반응

60∼80% 탈아세틸화 키토산(B, C, D, H, I)은 저온과 저농도의 알칼리 가수분해조건의 균일반응으로 제조하였다. 그리고 110∼125oC의 고온과 고농도(40%이상의 알칼리농도)의 불균일 반응으로 키토산(A, E, F, G)을 제조하였으며, 두 가지 모두 탈아세틸화도가 다른 부분 탈아세틸화 키토산을 기질로 사용하였다. 그리고 N-아세틸-D-글루코사민 올리고당들을 경제적으로 저렴하게 제조하기 위하여 효소 키티나아제 역시 조효소를 직접 반응시켰다. 조효소 키티나아제와 키토바이아제 (1.5 와 3.48units)의 2mL, 0.1M 아세테이트 완충용액(pH 6.0), 5mL의 2% NaN3 혼합용액에 균일반응 조건에서 제조된 부분적으로 탈아세틸화 키토산(60∼80%)  0.6%로 500 mL를 제조한 효소반응 혼합물을 37oC에서 48시간 반응시킨 후 5분간 끓임으로서 반응을 정지하였다.  반응 혼합물은 35℃이하에서 감압한 회전 증발기에서 농축시켰으며 전기투석기(Micro Acilyzer G1, Asahikasei kogyo Co., Ltd.)에 의하여 투석하였다.  투석용액은 1N 아세트산을 가하여 pH 6.0으로 조절하였다. 키티나아제 활성 1 unit는 1분간에 환원당 1mol을 생성시키는 효소의 양으로 정의하였다.

3. 활성탄 칼럼을 이용한 올리고당의 분리

활성탄(charcoal)은 크로마토그래피용(Wako社)으로 그 입자의 크기가 residue 300□ : max. 40%, 300∼63□ : min. 50%, pass 63□ : max. 10%를 사용하였고 아세트산으로 탈기 후 5×35□의 칼럼에 충진 후, 효소 가수분해 결과 생성된 올리고당 용액을 200mL/hr의 속도로 투입하여 분리하였다.

결과 및 토론

활성탄 600mL를 물에서 세정한 후, 30% 아세트산을 가하여 3시간 끓이고 탈기시키고 칼럼에 충진시킨 후에 부분 탈아세틸화 키토산을 효소 가수분해한 용액을 첨가하였다. 초기에 물에서 용출시킨 키토 올리고당을 HPLC에 의하여 검출하고 200mL/hr를 분획한 용출액을 215nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 올리고당 peak를 나타낸 용출 곡선을 도식화한 것이 Fig. 1이다. 용출 용매의 에탄올 농도를 단계적으로 5∼40%로 변화시키면서 용출하였다. 각 용출 분획물을 분석한 결과, 물에서는 N-아세틸-D-글루코사민 1당과 D-글루코사민 1, 2, 3당을 각각 용출 하였다. 에탄올 5∼25%에서 N-아세틸-D-글루코사민 1당∼5당까지의 혼합물을 용출 시켰으며 6당 이상은 검출되지 않았다.

Fig. 2.는 효소반응에서 생성된 환원당(mg/mL)의 양으로서 시간경과에 따른 최대 올리고당 생성량은 48시간에서 불균일 반응에 의해 생성된 부분 탈아세틸화 키토산에서 최대 2.7mg/mL로 나타났다. 반응의 초기 단계에서는 균일 반응에 의해 생성된 부분 탈아세틸화 키토산에서 더 많은 저분자량의 올리고머가 생성됨을 알 수 있었고, 부분 탈아세틸화 키토산을 이용한 키토올리고머 생성을 위하여 효소반응시간은 24시간 또는 48시간이 적합하다.

Fig. 3.에서는 효소가수분해의 상대속도를 비교하였는데, 콜로이달 키틴을 100%로 두었을 때 균일반응에서 생성된 60∼80%의 키토산이 가장 적합한 기질로 나타났으며, 불균일 반응에서 생성된 기질 중에서는 sample E(75% 탈아세틸화 키토산)가 가장 적합한 기질로서 상대 반응속도가 상당히 높아서 많은 올리고당을 생성하는 것으로 나타났다.

결론적으로 부분 탈아세틸화 키토산의 효소 가수분해에서 균일반응으로 생성시킨 60∼80%의 부분 탈아세틸화 키토산이 키토올리고당의 생성에 가장 적합한 기질로, 효소·기질 반응시간은 24시간이 적합한 것으로 나타났다. 활성탄 칼럼에 의해 용출시켜 분획한 생성된 키토올리고당의 조성은 N-아세틸-D-글루코사민 1당과 D-글루코사민 1, 2, 3당 이었으며, 에탄올을 용출 용매로 하였을 때  5∼25%에서 N-아세틸-D-글루코사민 1당∼5당이 생성됨을 알 수 있었다.

Fig. 1.	Chromatography of chito-oligosaccharides eluted from charcoal column. column size : 5× 35□ flow rate : 200mL/hr, and charcoal particle size : 300□(40%), 300∼63□(50%), and 63□(10%).

Fig. 2.	Time courses of the amount of reducing sugar from partially deacetylated chitosan by degradation of crude chitinase containing chitobiase. Enzymes from batch culture of Serratia marcescens at 37℃, pH 6.0.		Fig. 3.	Relative rate of enzymatic degradation according to several partially deacetylated chitosan samples. From among chitosan samples of substrates specificity, A, E, F, G were produced heterogeneously and B, C, D, H, I were produced homogeneously.

참고문헌

1. Bosso, C., Defaye, J., Domard, A., and Gadelle, A. Carbohydrate Research,     156, 57-68 (1986)

2. Izume, M., and Ohtakara, A. Agric. Biol. Chem., 51, 1189-1191 (1987)

3. Isume, M., Nagae, S., Kawagishi, H., and Ohtakara, A., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1327-1328 (1992)

4. Nanjo, F., Sakai, K., Ishikawa, M., Isobe, K., and Usui, T. Agric. Biol. Chem., 53, 2189-2195 (1989)

5. Usui, T., Matsui. H., and Isobe, K. Carbohydrate Research, 203, 65-77         (1990).

6. Lopatin, S. A., Ilyin, M. M., Pustobaev, V. N., Bezchetnikova, Z.A., Varlamov, V. P., and Davankov, V. A. Analytical Biochemistry, 227, 285-288 (1995).