초임계 이산화탄소를 이용한 Cyclodextrin의 생성

김상준, 고은용, 김 철, 유연우

아주대학교 화학공학과

Production of Cyclodextrins in Supercritical

Carbon Dioxide

Sang-Joon Kim, Eun-Yong Ko, Yeon-Woo Ryu, Chul Kim

Department of Chemical Engineering and Biotechnology, Ajou University

서  론

초임계유체는 기체상과 같은 낮은 점성과 높은 확산성으로 기질에서 효소로의 물질전달 속도를 높여준다. 또한 액체상과 같은 밀도를 나타내어 기체상에서 관찰된 것보다 높은 용해도를 가진다. 기체와 액체와는 달리 초임계 유체의 물리적 성질은 압력이나 온도의 적은 변화만으로도 광범위하게 조절할 수 있는 특징을 가지고 있어 최근에는 biocatalysis와 bioseperation 분야에 새롭게 적용되고 있는  분야이다. 초임계 유체중에서 이산화탄소는 인체에 무해할 뿐만 아니라, 불연성이고 화학적으로 안정하며 임계온도가 낮아서 일반적으로 가장 널리 사용되고 있는 물질이다[1].

Cyclodextrin은 다른 유기, 무기의 화합물과 포접물을 이룸으로써 휘발성 물질의 안정화, 산화방지, 광분해 물질의 보호, 용해도의 향상과 같은 여러가지 물질개선 효과가 있어서 식품, 의약품, 농약등 다방면에 걸처 유용하게 활용할 수 있으리라 예상되는 기능성 탄수화물계 생물 신소재이다. 현재, cyclodextrin(CD) 생산에는 amylase나 CGTase로 전분을 액화 또는 부분 환화시켜 수용성 전분으로 전환한 후, 수용성 CGTase를 첨가하여 반응시키는 수용성 균일상 효소반응계를 이용한 제조 공정이 주로 사용되고 있다[2].

생전분의 효소당화시 고형의 분쇄마찰매체를 첨가 교반함으로써 생전분에 대한 amylase 계통효소의 작용을 촉진시킨다는 발표가 보고된 바 있으며[3], 또한, 생전분을 이용한 cyclodextrin 생성반응에 수용성 유기용매를 첨가하여 반응시킴으로서 cyclodextrin의 생성 수율이 현저히 증가된다는 결과도 보고된 바 있다[4].

본 연구에서는 초임계 이산화탄소를 이용한 효소반응에 관한 연구를 수행, 초임계 이산화탄소하의 효소반응의 기본 특성 규명 및 최적 조건을 설정하고 이에 적합한 반응기를 설계하였다. 또한 초임계 유체하에서의 분쇄마찰매체 및 유기용매함유 효소반응계를 도입하는 연구를 수행함으로써, cyclodextrin생산에 적합한 최적반응 조건을 확립하였고, product inhibition mechanism을 규명하였다. 이와 같은 연구는 경제적이고 효율성 높은 새로운 cyclodextrin 생산공정 개발을 위한 기초적 자료로 활용될 수 있다.

실  험

1. 최적 기질 농도

상압, 60℃의 반응기에 생전분(Sigma, U.S.A.) 10g/L, 30g/L, 50g/L, 70g/L, 90g/L 각각을 0.1M sodium acetate buffer solution (pH 5.5) 100ml에 현탁하여 반응기에 넣고 CGTase(3000unit/ml, THORUZYME,Denmark) 200□L를 첨가하여 30min 동안 반응시킨 후, cyclodextrin의 생성량과 수율(yield)을 비교하였다.

2.분쇄마찰매체를 포함한 초임계 이산화탄소 반응조건에서의 CD 생성

생전분(Sigma, U.S.A.) 50g/L를 0.1M sodium acetate buffer solution (pH 5.5) 100ml에 현탁하여 반응기에 넣고 CGTase(3000unit/ml, THORUZYME,Denmark)

200□L를 첨가한 후, 상압, 60℃일 때와 초임계 이산화탄소 반응조건에서의Cyclodextrin의 생성량을 측정하였다. 또한, 분쇄마찰매체의 영향을 알아보기 위하여 위의 각각의 경우에 대하여 유리구(glass bead, 직경 3mm, 비중 2.54) 40g을 첨가하여 cyclodextrin의 생성량을 측정하였다. 생성된 cyclodextrin의 정량은 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC, waters 410 Differential Refractometer)를 사용하여 측정하였고, Column은 □Bondapak NH2 column(3.9×300mm), 용출용매는 acetonitrile과 water(75:25)의 혼합용액, 용출속도는 2.0mL/min 이었고, injector volume은 20□L이며, RI detector로 검정하였다.

3. 초임계 CO2내에서 enzyme반응에 대한 유기용매의 영향

초임계 CO2내에서 유기용매의 영향을 알아보기 위하여 활성도를3000unit/mL인 CGTase와 0.1M sodium acetate buffer solution (pH 6.0)을 혼합한 enzyme solution(2mL/L)에 starch 50g/L, Isopropanol(10%, v/v)를 넣은 후, 각각 상압에서와 초임계 CO2내에서 실험을 수행하였다. 반응 온도는 60℃, 교반 속도는 700rpm으로 하였으며, 24시간동안 cyclodextrin의 생성반응을 수행하였다.

4. CGTase에 대한 유기용매의 영향

유기용매 함유 효소반응계에서 CGTase에 의한 cyclodextrin의 분해 정도를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

활성도가  3000unit/mL인 CGTase와  0.1M sodium acetate buffer solution (pH 6.0)을 혼합한 enzyme solution(2mL/L)에 10mM의 □-cyclodextrin를 넣은 후, Isopropanol (10%, v/v)을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 각각에 대해 maltose를 50mM 첨가하여 실험을 수행하였다. 반응 온도는 60℃, 반응 시간은 3hr, 교반속도는 300rpm으로 1시간마다 시료를 채취하였다.

결과 및 고찰

Fig.1은 반응 시간에 따른 cyclodextrin의 생성 곡선을 나타내었다. 반응시간이 30분까지는 cyclodextrin의 생성속도가 급격히 증가하였으며 30분 이후부터는 CD의 생성속도가 다소 낮아짐을 알 수 있었다.

Fig.2는 상압, 60℃일때와 초임계 이산화탄소 반응조건에서의 cyclodextrin의 생성량을 측정하고, 위의 각각의 경우에 대하여 bead를 첨가한 경우에 대한 결과를 나타내었다. 24hr동안 반응시킨 결과, 약 3hr까지는 상압에서의 cyclodextrin의 생성량이 더 높게 나타났으나, 3hr이후에는 분쇄마찰매체를 함유한  초임계 이산화탄소 반응조건에서 cyclodextrin의 생성량이 가장 높게 나타났음을 알 수 있다. 이는 초임계CO2의 압력에 의한 starch의 팽윤과 이로 인한 enzyme의 accessibility증가로 cyclodextrin생성량이 증가됨과 동시에 분쇄마찰매체에 의한 전분입자의 단편화에 의해 cyclodextrin의 생성수율이 증가된 것으로 사료된다.

fig.3은 수용성 유기용매인 Isopropanol이 10% 함유된 경우와 함유시키지 않은 경우 각각에 대하여 상압하에서와 초임계 CO2하에서의 cyclodextrin의 생성량을 비교한 그림이다. 초임계 CO2하에서도 유기용매에 의한 cyclodextrin의 생성량은 증가하였다. 따라서, 초임계CO2는 유기 용매에 의한 cyclodextrin의 증가에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 또한, 초임계 CO2와 유기 용매를 이용함으로써 상압에서 보다 27%의 cyclodextrin의 생성량이 증가됨을 알 수 있었다. 그리고 수용성 유기용매가 함유된 반응계에서는 24시간 반응후에도 생성된 cyclodextrin의 감소가 일어나지 않았으며 이를 밝히기 위해 CGTase에 대한 유기용매의 영향을 실험하였다.

Fig.4는 CGTase에 의한 cyclodextrin의 분해에 미치는 수용성 유기용매의 영향을 나타낸 것이다. 수용성 유기용매인 Isopropanol을 10% 첨가시켜 반응시킨 경우 CGTase에 의한 □-cyclodextrin의 분해가 현저히 감소하였음을 알 수 있다. 따라서 수용성 유기용매는 CGTase에 의한 cyclodextrin의 생성반응을 촉진시키기 보다는 생성된 cyclodextrin를 분해하는 CGTase의 작용을 억제시키는 역할을 한다고 사료된다.

참고문헌

[1]. Olli Aaltonen, Markku Rantakyla; CHEMICAL APRIL  pp 240-248 (1991)

[2]. Hitoshi, H., K. Hara, N. Kuwahara, T. Ohki and M. Ishikawa; J. Jpn. Soc.          Starch Sci., 32, 307 (1985)

[3]. 이용현, 조구형; 산업 미생물 학회지. pp 14-29 (1986)

[4]. Han, Il-Keun, Yong-Hyun. Lee; Kor. J. APPL. Microbiol. Biotechnol. 19. pp         163-170 (1991)