Trametes sp.에서 생산되는 laccase에 의한 염료의 색도 제거

권신, 류원률, 조무환

영남대학교 응용화학공학과

Decolorization of Dyes with Laccase from Trametes sp.

Sin Kwon, Won Ryul Ryu, Moo Hwan Cho

School of Chemical Engineering & Technology, Yeungnam University

서론

산업의 발달과 함께 각종 오염물질의 배출이 증가하고 있다. 특히 방향족 구조를 갖는 난분해성 오염물질이 급증하고 있으며, 이들은 인체에 매우 유해한 것으로 알려져 있다. 특히 합성염료는 섬유, 종이를 비롯해 문방구, 화장품, 식품 그리고 최근에는 액정, 컬러 필름용 색소 등 전자 기기 관련분야로 폭넓게 사용되고 있으며 현재 국내 염료 생산고는 연간 약 7 만 톤으로 전세계생산량의 10% 정도이고, 염료생산과정에서 배출되는 1차 폐수는 약 100 만 톤으로 추정된다. 최근에는 폐수의 색도제거 이외에도 염료공업에 관계되는 각 회사들이 폐수처리 기술을 통하여 각종 처리를 거친 후 폐수를 리사이클 하여 재사용 하는 부분에도 많은 노력을 하고 있다. 그러나 방향족 구조를 가지는 난분해성 물질들은 그 자체의 독성으로 인해 생물학적으로 처리하기가 어렵고, 물리화학적 처리는 새로운 문제점을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 염료를 비교적 효율이 높은 생물학적 기술을 이용하려는 움직임이 최근에 들어와서 활발히 진행되고 있으며, 그 중에서도 특히 환경오염물질의 bioremediation기술에 적용 가능한 백색부후균에 관한 연구가 지속되고 있다. 1990년 Cripps 등은 Orange II, Trapaoline, Congo red 등의 염료를 Phanerochaete chrisosporium을 이용하여 호기적 상태하에서 분해하였으며, crude lignin peroxidase를 P. chrisosporium에서 추출한 후 염료분해를 시도하였다. 이후 Paszcynski등은 P. chrisosporium과 streptomyces종을 이용하여 화학합성한 azo 염료를 분해하였으며, 그들은 염료의 분해 반응기작에 P. chrisosporium에서 분리된 ligninase와 manganese peroxidase에 의해 분해됨을 보고하였다. Paszcynski와 Crawford는 ligninase의 기질로서 veratryl alcohol의 존재 하에 ligninase에 의한 azo 염료의 산화가 촉진되는 것을 보고하였다. 1998년에 신 등은 Pleurotus ostreatus를 이용하여 Bromophenol Blue등을 제거하였음을 보고하였고 Heinfling 등은 Bjerkandera adusta 와 Pleurotus eryngii 균주에서 생산된 MnP를 이용하여 Mn2+가 존재하지 않은 상태에서 공업용 염료를 분해하였다고 보고하였다. 이와 같이 백색부훈균에서 생산되는 ligninase는 기질 비특이성으로 대부분의 염료를 분해할 수 있다고 보고 되고 있다. 따라서 본 연구에서는 ligninase중에서 laccase를 이용하여 산업적으로 많이 사용되고 있는 여러 가지 염료에 대하여 색도 제거가 가능한지 그 타당성을 검토하였고, Lineweaver-burk plot을 이용하여 laccase의 염료 분해 반응에 대한 Michaelis-Menten kinetic constants를 측정하였으며, dye decolorization과  효소 활성도의 상관관계를 측정하였다.

이론

Laccase는 일반적으로 백색부후균에서 발견되며 lignin 합성 화합물을 중합하거나 해중합하기 위하여 phenolic hydroxyl기로부터 하나의 전자를 분리하는 촉매 작용을 한다. laccase는 □-1과 □-0-4 dimer를 C□-C□의 분리와 C□산화와 alkly-aryl 분리를 통해 분해한다. 또한 aromatic ring 분리가 laccase의 작용에 따라 감지될 수 있다. laccase는 LiP와 MnP와 마찬가지로 리그닌을 분해 할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났다. laccase는 1883년 일본 lacquer 나무의 수액에서 발견되었으며 Bertrand에 의해 laccase라 이름지어졌다.

laccase활성이 우수한 균주로는 자낭균인 Aspergillus nidalans, Neurospora crassa와 담자균인 Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Cerrena unicolor, Lentinus edodes 등이 존재한다.

실험

Trametes sp.(KFCC 10941)는 온도 28。C, pH4.5인 YMPG배지액에서  6일 동안 배양되었고, 그 액체 배양액중 균사체만 분리하여 멸균 증류수로 세척후, extracellular laccase를 생산하기 위해서 Tien, Kirk(1988)에 의해서 사용된 질소충분 액체배지에 접종하여 laccase를 생산하였다.

laccase의 활성 측정을 위해서는 laccase가 ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzthia -zoline-6-sulphonate)를 기질로 이용하여 420 nm에서 산화되면서 생성되는 생성물의 흡광도 증가를 측정하였다. 반응 혼합물은 0.1 M sodium acetate (pH 5.0) 완충액에 시료를 혼합한 후 5 mM ABTS (2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline -6-sulphonate)를 첨가하여 1분간 420 nm에서 흡광도의 차이를 측정하였다. 효소의 활성단위는 분당 1 □M의 ABTS를 산화시키는 효소의 양을 1 unit로 정의하였다. Molar extinction coefficient는 36,000 M-1cm-1이다.

각 염료의 농도 분석은 UV-Visible spectrophotometer를 사용하여 최대 흡광 파장에서의 흡광도로 분석하였다.

laccase에 의한 염료의 분해 실험은 0.1 M sodium acetate (pH 5.0) 완충액과 부분적으로 정제된 laccase와 각각의 염료를 반응시켜 그 분해능을  측정하였다. 또한 laccase 산화의 mediator로 알려진 HBT를 첨가하였을 때와 비교하여 보았다. 각 실험은 UV-Visible spectrophotometer로 1□큐벳에서 시간별로 농도를 측정하였다. 실험 온도는 상온인 25℃이며 각 반응용액의 첨가 비율은 laccase의 assay할 때와 동일하게 실행하였다.

결과 및 토론

Laccase에 의한 염료의 분해 실험은 0.1 M sodium acetate (pH 5.0) 완충액과 부분적으로 정제된 17U/□의 laccase와 각각 50ppm의 염료를 1□ 큐벳에서 반응시켜 그 분해능을 UV-Visible spectrophotometer로 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다. laccase는 반응성 염료인 Reactive Blue 19의 경우 최대 흡광 파장에서흡광도의 99%를 분해하였으며, 분산염료인 Disperse Red 60을 제외하고는 여러가지 염료의 분해능을 가지는 것을 볼 수 있다. 또한 HBT첨가에 따른 분해능을  살펴볼때 다소 분해율의 증가를 볼 수 있으나, 큰 차이는 보이지 않았다. Michaelis-Menten kinetic constants는 효소와 대상 기질의 상호작용의 특성을 나타내며 초기 효소 농도에 비례하여 증가되는 값으로 효소의 최대 반응속도를 나타내는 중요한 매개변수들이다.

Table . Dye decolorization by laccase in presence and absence of

1- hydroxybenzotriazole at pH 5.0, temperature 25。C

Dye	Decolorization rate(%)
	Laccase １ HBT	Laccase ／ HBT
Direct Yellow 28	68	73
Disperse Red 60	30	30
Reactive Blue 19	99	99
Reactive Black-5	54	71
Acid Blue 40	84	84
Acid Red 57	89	92
Acid Blue 113	81	84

그러므로 laccase와 기질의 반응 특성 및 laccase의 특성을 관찰하기 위해서 ABTS, Acid Blue 40과 Acid Blue 113의 Michaelis-Menten kinetic constants를 구해보았다. Fig.1은 30U/L의 laccase를 사용하여 ABTS에 대한 Lineweaver-Burk plot으로써 ABTS의 농도를 12.5 - 250□M로 달리하여 ABTS의 분해를 측정하였고, Fig.2는 100U/L의 laccase를 사용하여 Acid Blue 40의 농도를 35 - 105□M로 달리하여 측정하였으며, Fig.3은 30U/L의 laccase를 사용하여 Acid Blue 113의 농도를 8 - 54□M까지 변화시켜가며 측정하였다. 각각의 기질에 대한 Michaelis-Menten kinetic constants인 Km, Vmax는 Tables 2에 나타내었다.

Table  Kinetic constants of laccase for each substrates

Substrates	Km(□mol)	Vmax(□mol/min·U)
ABTS	29	2500
Acid Blue 40	30	1250
Acid Blue 113	16.6	666.6

Acid Blue 40, Acid Blue 113의 decolorization과 효소 활성도의 상관관계를 도식한 그림을 Fig. 1에 나타내었다. 그림같이 Acid Blue 40과 Acid Blue 113의 분해 속도와 효소 활성도는 거의 선형적으로 비례함을 알 수 있다.

Fig.. Lineweaver-Burk plot for

the ABTS degradation

by laccase

Fig. Lineweaver-Burk plot for

the Acid Blue 40                     degradation by laccase

Fig.. Lineweaver-Burk plot for

the Acid Blue 113                    degradation by laccase

Fig. .  Correlation between laccase activity and dye decolorization rate of Acid Blue 40 and Acid Blue 113.

참고문헌

1. Bumpus, J., M. Tien, D. Wright and S. Aust :, Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus, Science, 228, 1434-1436. (1985)

2. Paszcynski, A., M. B. Goszcynski, and D. L. Crawford : New approach to improve degradation of recalcitrant azo dyes by Streptomyces and Phanerochaete chrysosporium, Enzyme Microb. Technol., 13, 378-384. (1991)

3. Higuchi, T. :, Mechanisms of lignin degradation by lingnin peroxidase and laccase of white-rot fungi, ACS symp. Ser., 399, 482-502. (1989)

4. Ryu W. R., Shim S. H., Jang M. Y., Jeon Y. J., Oh K. K., and Cho M. H. ,: Biodegradation of pentachlorophenol by white rot fungi under ligninolytic and nonligninolitic conditions, Biotechnol. Bioprocess Eng., 5, 211-214. (2000)

5. Pilar Reyes, Michael A.Pickard & Rafael Vazquez-Duhalt : Hydroxybenzotriazole increases the range of textile dye decolorized by immobilized laccase Biotechnology Letters 21 : 875-880. (1999)

6. Elizabeth Rodriguez, Michael A. Pickard, Rafael Vazquez-Duhalt : Industrial Dye Decolorization by Laccase from Ligninolytic Fungi, Current Microbiology Vol. 38, pp.27-32. (1999)

7. Christopher F. Thurston : The structure and function of fungal laccases, Microbiology 140, 19-26. (1994)