혐기성 조건하에서 토양내 다핵성 방향족 화합물의 생물학적 분해

안익성, Upal Ghosh*, Richard G. Luthy*

연세대학교 화학공학과, 미국 Carnegie Mellon Univ. 환경공학과*

Biodegradation of Polynuclear Aromatic Hydocarbons in soil

under Anaerobic Conditions

Ik-Sung Ahn,Upal Ghosh*, Richard G. Luthy*

Dept. Chem. Eng. Yonsei Univ. Seoul, Korea,

Dept. Civil & Environ. Eng. Carnegie Mellon Univ. Pittsburgh, PA USA*

서론

naphthalene, phenanthrene 등의 다핵성 방향족 화합물(Polynuclear Aromatic Hydrocarbons(PAH))들은 유전 지대, 석탄 광산, 주유소 누출 사고 지역의 토양에서 흔히 발견되는 환경오염유발 물질로서, 발암성으로 인해 미국 EPA(Environmental Protection Agency)의 Priority Pollutant List 에 올라있는 맹독성 물질이다. PAH는 hydrophobic 하여 물에 거의 녹지 않으며, 토양의 유기층 (Soil Organic Matter)와 소수성 결합을 형성한다. 그리하여 토양이 PAH로 오염되면 이들은 쉽게 제거되지 않으며, 지하수내에 낮은 농도로, 오랜 기간 누출된다고 알려져 있다. 다시 말해 종래의 Pump and Treatment 방법으로는 제거가 불가능하다. 토양 오염원으로서 PAH의 처리를 위해 생물학적 분해 방법이 크게 각광받고 있다. 이는 물리적이나 화학적인 방법들에 비해 오염물들을 이산화탄소와 물, 그리고 생물체(biomass)라는 무해물질로 전환시킬 수 있다는 장점과 특히 in-situ treatment 법은 비용면에서 훨씬 경제적이라는 장점이 있기 때문이다.

PAH의 생물학적 분해 방법으로는 호기성 조건하에서 미생물을 이용하는 법이 가장 널리 연구되었으며, 많은 균주들이 발견되었다. 호기성 조건에서는 산소가 미생물의 전자전달계의 electron acceptor 뿐만 아니라 PAH의 산화제로 작용한다. 그런데 실제 토양내에는 호기성 조건을 유지하기가 힘들다. 토양내 유기층과 오염물의 분해로 산소가 고갈되었으며, 산소의 낮은 수용성, 대기에서 토양 내로의 물질전달의 제한으로 인해 표면층을 제외하고는 토양내는 혐기성 조건하에 있다고 알려져 있다. 호기성 분해를 위해 토양내로 공기 및 산소를 주입하거나 오염된 토양을 채취하여 외부에서 처리하는 ex-situ treatment 법이 비경제적이므로, 혐기성 조건하에서의 생물학적 처리가 최근 크게 관심을 받고 있다. 그러나 혐기성 조건하에서 PAH의 생물학적 분해는 거의 알려진 것이 없는 실정이다 (Coates et.al) 호기성 분해의 산소를 대신할 electron acceptor로서 nitrate, sulfate, ferric ion 등을 생각할 수 있다 (Zehnder). nitrate의 경우 nitrate가 nitric oxide를 거쳐 nitrous oxide, nitrogen gas로의 환원이 일어나는 denitrification을 생각할 수 있다. PAH의 한 예인 나프탈렌의 호기성 분해와 혐기성 분해의 물질 수지는 complete oxidation을 가정할 때 아래의 식으로 표시할 수 있다.

호기성 분해: 1/48 C10H8 + 1/4 O2	→   10/48 CO2 + 1/12 H2O

혐기성 분해: 1/48 C10H8 + 1/24 H2O	→   10/48 CO2 + 1/4 H+ + e-

1/5 NO3- + 6/5 H+  + e-	→   1/10 N2 + 3/5 H2O

본 연구의 목적은 i) denitrification 조건하에서 토양내 PAH의 생물학적 분해 여부를 알아보고, ii) PAH의 한 예로서 나프탈렌을 선택하여 오염 토양내 미생물군에 의한 나프탈렌의 생물학적 분해를 조사한다. iii) 마지막으로 혐기성 조건하에서 나프탈렌을 분해하는 미생물 균주를 분리하는 것이다. 위의 첫 번째와 두 번째 목적의 달성은 PAH의 혐기성 분해에 대한 증거가 될 것이며, 마지막의 세 번째 목적, 단일 균주의 분리는 PAH의 생물학적 분해에 대한 mechanistic study를 가능하게 하며, 이를 바탕으로 한 혐기성 분해 방법의 설계 및 최적화를 가능하게 할 것이다.

실험

1. Bioslurry Experiments

토양으로는 미국 Milwaukee Harbor 지역의 Confined Disposal Facility에 있는 sediment를 사용하였다. 이 토양을 MHS라 명명하기로 한다. Bioslurry reactor로 마개가 달린 500 mL 유리 플라스크에 135 g의 MHS (35% water content)와 pH 7의 minimal medium 300 mL을 가입하였다. 혐기성 조건의 reactor에는 초기에 120 mg NO3-/L의 농도로 KNO3를 가입하였다. Abiotic control 실험을 위해 sodium azide를 500 mg/L의 농도로 가입하였다. Minimal medium의 조성은 다음과 같다: 0.4g/L K2HPO4; 0.317 g/L NaH2PO4H2O; 0.216 g/L NH4Cl; 0.1 g/L MgSO4; 1.0 mg/L FeSO4.7H2O; trace elemental substances (TES) 1.0 mL/L. TES의 조성은 다음과 같다: 0.15 g/L ZnNO36H2O; 0.1 g/L MnCl24H2O; 0.062 g/L H3BO3; 0.19 g/L CoCl26H2O; 0.035 g/L  CuSO45H2O; 0.027 g/L NiSO46H2O; 0.026 g/L  (NH4)6Mo7O244H2O; 5.2 g/L EDTA. 반응기 내 slurry의 산소제거(deoxygenation)를 위해 Ar gas를 사용하였다. 반응기들은 즉시 Glove Box로 옮겼다. 하루에 두 번씩 반응기 내 slurry들을 교반하여 주었다. 적당한 시간 간격을 두면서 상등액 샘플을 채취하여 nitrate 등의 농도를 측정하였다. nitrate의 고갈을 막기위해 추가적인 공급이 이루어졌다. 실험 온도는 24。C로 유지되었다. 실험의 종료 시점에 토양내의 PAH를 분석하였다. EPA method 3550B를 사용하여 PAH를 토양으로부터 추출하였으며, PAH의 농도는 Gas Chromatography로 분석하였다. 상등액 내 nitrate 등의 음이온 농도는 Ion Chromatography로 분석하였다.

2. Microcosm Experiments

위의 bioslurry를 vortex mixing으로 토양내 미생물의 탈착을 유도한 후 상등액10mL를 취하여 50mL vial로 옮긴다. 산소가 제거된 minimal medium 40 mL를 가입하고 나프탈렌과 nitrate를 각각 20 ppm, 120mg/L으로 가입한다. 24。C에서 tube rotator로 교반을 수행하면서 배양하였다. Bioslurry를 옮기는 과정에서 vial 안으로 미량의 토양이 함께 전해진다. 이들 토양을 최소화하기 위해 나프탈렌과 nitrate의 소비를 확인한 다음, vial내 토양이 가라앉았을 때, cell suspension 10 mL를 새 vial로 옮기고 minimal medium 40 mL를 가입하고 나프탈렌과 nitrate를 추가 가입하였다. 이와 같은 과정을 2차례 반복하므로써 vial내 잔존 토양은 육안으로는 관찰할 수 없었다. 나프탈렌의 토양 흡착 가능성을 무시할 수 있으므로 나프탈렌과 nitrate의 소비는 오직 나프탈렌이 denitrification 조건하에서 생분해되기 때문이다. 나프탈렌과 nitrate의 농도는 HPLC와 Ion Chromatography에 의해 측정하였다. 필요할 경우 나프탈렌과 nitrate를 추가 가입였다.

3. Strain Isolation

위의 microcosm experiment에서 얻어진 cell suspension의 균주들을 분리하였다. 우선 나프탈렌을 호기성 조건에서 분해할 수 있는 균주들을 찾은 후, 이들을 다음의 세가지 조건 하에서 배양하였다: i) abiotic control; ii) nitrate를 가입하지 않은 경우; iii) nitrate를 가입한 경우. 두 번째 조건에서 나프탈렌의 분해가 일어난다면 나프탈렌의 분해가 denitrification과 연계된 것이 아님을 의미한다. 분리된 균주 하나를 16S rRNA analysis와 fatty acid analysis를 통해 균주 분류(Strain Identification)를 하였다.

결과 및 토론

Bioslurry Experiment에서  혐기성 분해 전과 후의 토양내 PAH의 농도를 아래 그림 1에 나타내었다. 3-ring 또는 4-ring을 갖는 PAH들의 생분해가 두드러지며, high molecular weight를 갖는 PAH의 분해는 거의 일어나지 않았다. 이들의 토양 흡착이 너무도 강하기 때문에 초래된 것으로 믿어진다. 다른 그룹에서 수행한 MHS 내 PAH의 호기성 분해에서도 high molecular weight를 갖는 PAH의 분해는 거의 일어나지 않았다 (그림 2 참조). Bioslurry내 nitrate농도의 변화는 그림 3에 나타나 있다. Denitrification에 의해 nitrate의 감소가 일어났으며 이에 따라 nitrate의 추가적인 공급이 필요하였다. 또한 denitrification 중간물인 nitrite가 관찰되었다. Abiotic control에서는 nitrate의 변화와 nitrite의 출현이 전혀 관찰되지 않았다. 그러므로 MHS 내 PAH들이 denitrification 조건 하에서 생분해됨을 확인하였다.

Microcosm Experiment으로 혐기성 조건 하에서 MHS 내 미생물 군에 의한 나프탈렌의 분해가 nitrate의 소비(denitrification)가 서로 연계되어 있음을 확인하였다. 미생물군의 분리를 통해 denitrification 조건 하에서 나프탈렌을 생분해 할 수 있는 미생물 균주 하나의 확인 실험 결과가 그림 4에 나와 있다. 좌측 그림에 보이듯이 abiotic control과 nitrate를 가입하지 않은 경우 나프탈렌의 농도는 일정하

그림 1. 혐기성 분해 전후의 MHS 내 PAH 분포

그림 2. 호기성 분해 전후의 MHS 내 PAH 분포

게 유지되었다. nitrate를 넣어 준 경우에만 나프탈렌의 분해가 일어났다. 우측 그림은 nitrate의 농도 변화를 보여주고 있다. Abiotic control 경우에는 nitrate의 변화가 없었으나 나프탈렌의 분해가 일어나는 경우에서는 nitrate의 감소가 일어났다. 그러므로 이 미생물 균주는 denitrification 조건 하에서 나프탈렌을 분해할 수 있다고 결론 지을 수 있다. 16S rRNA 분석과 fatty acid 분석법에 의해 이 균주

그림 3. 혐기성 조건하에서 Bioslurry 내 nitrate 농도의 변화

그림 4. 혐기성 조건 하에서 단일 균주에 의한 나프탈렌의 분해와 nitrate 소비

는 Pseudomonas fluorescence로 분류되었다.

참고 문헌

Coates, J.D., Woodward, J., Allen, J., Philip, P., and Lovley, D.R., "Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in petroleum contaminated marine harbor sediments", Appl. Environ. Microbiol. 63, 3589(1997).

Zehnder, J.B., "Biology of anaerobic microorganisms", John Wiley, New York, NY (1988).