작두콩으로부터 유용성분의 추출 및 정제

(Ⅰ) Isoflavones류의 HPLC 분석

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

이광진, 강지훈, 한순구, 정광수*, 노경호

초정밀생물분리기술센터, 인하대학교, 화학공학과

*도우미화장품

Extraction and Purification of Canavalia ensiformis

(Ⅰ) HPLC Analysis of Isoflavones

Kwang Jin Lee, Ji Hoon Kang, Soon Koo Han, Kwang Soo Jeong*, Kyung Ho Row

Center for Advanced Bioseparation Technology and Dept. of Chem. Eng., Inha University,

253 Yonghyun-Dong, Nam-Gu, Incheon 402-751, Korea

*Functional Cosmetic of Dowomi Cosmetic Co., Ltd

서론

작두콩(Canavalia ensiformis)는 콩과(Leguminosae)의 한해살이 덩굴로서 줄기에 털이 없으며, 대체로 6-7월에 꽃이 피며, 8-10월에 걸쳐 열매인 꼬투리를 맺고 늦가을에 열매가 익는다. 열매가 활 모양으로 구부러진 꼬투리여서 그 모양이 작두처럼 생겨서 작두콩, 도두 및 칼콩이라고 불린다. 동남아시아 열대지방이 원산지로 옛날에는 우리나라에 더러 심었으나 요즘은 거의 심지 않아 아는 사람이 드물고, 작두콩(Canavalia ensiformis)은 작물학적 가치를 지닌 실용성 작물로서도 높은 가치를 지닌 실용성 작물이다[1]. 그 약리 효능은 화농성 질환, 위나 장이 허냉하여 생긴 염증, 궤양, 신장이 허약해서 생기는 허리아픔, 정력 감퇴, 혈액순환장애, 변비 및 비만 등의 치료에 탁월하고, 주요 성분으로는 씨에 포함되어 있는 우레아제, 혈구응집소, 카나바린 및 단백질과 이외에 글루코시다제, 아르기나제 등이 있으며, 다른 콩과 작물에 비하여 비타민 A, C, B군이 4-5배 가량 더 많이 존재한다[2]. 그 중에서 lectin류의 혈구응집소인 Concanavalin A(Con A) 구조는 protein chain에 carbohydrates가 연결되어있는 일종의 glucoprotein이고, pH 5.5 미만의 분자량 (MW26000)의 monomeric subunits에서 termer(MW 104000)로 형성되어 있다. 우레아제(Urease), 카나바린(Canavanine)의 성분은 종양세포에 대한 특수작용이 있는 것으로 알려져 있으며[3]. 여러 가지 글로불린으로 되어있다. 또한 항산화 활성에 대한 Flavonoid의 화합물은 화학 구조에 있어서 phenol기를 함유하고 있고[4], 항산화 효과를 가지고 있는 물질로서 isoflavone류, saponin류, lecithin류, 단백질, peptides, amino acids 등이 거론되고 있다. Figure 1에 isoflavone의 화학구조를 나타내었고, 이러한 isoflavone류에는 daidzin, genistin, glycitin, daidzein 그리고 glycitein의 성분[5-6]과  isoflavonoid 생합성의 중간조절의 해결 인자이다[7].

Davison & Elliott(1952)은 건조콩 가루를 물에서 추출하여 isoelectric 침전으로 처음 식물 재료로부터 효소를 분리하였다[8]. 또한 1903년 러시아 생화학자, Mikhail Tswett는 분필가루로 채워진 칼럼을 사용하여 식물의 잎에서 추출한 색소를 정제하였다[9].

본 연구에서는 정밀화학과 생화학분야의 물질 정제과정에서 크로마토그래피의 분석 및 분리의 최적 조건을 통해 작두콩에서의 유용성분인 isoflavone류를 의약품 및 화장품원료에 적용하기 위한 최적의 조건을 찾고 생산량을 높게 하기위한 대규모의 scale-up이 연구의 목적이다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

실험

1. 실험재료

우리나라에 자생하는 작두콩(2001년 채취)을 구입하였고, 아래에는 구입한 작두콩의 꽃과 열매를 나타낸 사진이다. HPLC 이동상으로는 J. T. Baker사의 methanol, acetonitrile과 2차 증류한 증류수를 감압 펌프(Division of Millipore, Waters)와 필터(FH-0.5 □)를 이용하여 감압 여과 한 후에 사용하였다.

Canavalia ensiformis

2. 추출, 정제 및 분석

삼각 Flask에 작두콩 가루 6g을 넣고  ethanol 20□를 적당량 넣는다. 3시간 동안(2회) 두었다가 filtration을 한 뒤 rotary evaporator(40□)로 ethanol을 제거하고 ether를 균등하게 넣어 분별시킨다. 다음 rotary evaporator(40□)로 solution을 제거하고 methanol로 용해하여 남게한 뒤 0.45□ Filter로 여과한다. 추출된 시료는 농축을 하기 위해서 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였고, 시료의 분석에 사용된 HPLC는 영린기기의 M930 Solvent Delivery Pump, 486 검지기(M 7200 Absorbance Detector, 영린기기), Reodyne injection valve(20 □ sample loop)로 구성되어 있다. 데이터 저장 시스템(data acquisition system)은 Autochrowin(ver. 1.42, 영린기기)을 PC에 설치하여 사용하였다. Table 1은 작두콩의 추출 시료를 HPLC로 분석하기 위한 조건을 나타낸 것이다.

Table 1. Analysis condition of HPLC

Instrument	Waters HPLC
Column	□-Bondapak C18 (3.9 □ 300 □)
Gradient method	water/acetonitrile/methanol/acetic acid
Flow rate	1□/min
Wavelength	254, 280nm

결과 및 고찰

천연물의 분리가 시도된 것은 18세기말부터이며, 근대 과학적 연구 진행은 19세기에 들어서이다. 작두콩(Canavalia ensiformis)의 부위별 화학성분을 Table 2에 나타내었다.

Table 2. The general composition of Canavalia ensiformis.

	건조종자(%)	새콩(%)	꼬투리(%)
수분	14.9	88.6	89.2
단백질	27.1	2.7	2.8
탄수화물	53.8	6.4	7.3
지방	0.6	0.2	0.2
회분	3.6	0.6	0.5
섬유질	11.6	1.5	1.5

일반적인 성분 함량이 건조 종자와 새콩, 꼬투리에서 수분은 88.6%로 꼬투리가 높았고, 단백질과 탄수화물은 건조종자에서 27.1%와 53.8%로 높았다. 이외 작두콩의 유용성분들중 비타민 A, C, B군이 다른 작물에 비해 더 많이 존재하고 글로불린으로 되어있는 저장 단백질인 Canavalin 및 lectin류의 Concanavalin A는 종양세포에 대한 특수 작용이 있다.

Figure 2에서는 항산화 효과를 가지고 있는 isoflavone류의 daizin, glycitin, genistin, daidzein과 glycitein의 성분을 Soybean의 추출 및 정제를 통해 HPLC 분석한 결과이다. 이러한 isoflavone류가 많이 포함되어 있는 작두콩(Canavalia ensiformis)에서도 유용성분의 고부가가치 적용을 위해 최적의 조건 확립이 요구된다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

알림

본 연구는 인하대학교 고순도분리연구실에서 수행하였으며, 초정밀분리기술센터와 도우미화장품의 지원에 감사드립니다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

참고문헌

1. M. Hofstetter, S. Nyiredy, B. Meier, and O. Sticher, Journal of Chromatography, 407, 319-  323 (1987).

2. 작두콩의 항산화물질의 분리와 항산화 효과　충북대 2000년 (석사).

3. 작두콩 Canavalia ensiformis L.) 줄기 유래 Callus 로부터 식물체 재분화　계명대 2001년    (석사).

4. 작두콩으로부터 황산화 물질 탐색에 관한 연구　건국대 2001년 (석사).

5. E. Farmakalidis, and P. A. Murphy, Journal of Chromatography, 295, 510-514 (1984).

6. Dynamic method에 의한 흡착평형식의 결정과 콩으로부터 isoflavone 인하대 2000 (석사)

7. Robert E. Carlson, and David Dolphin, Journal of Chromatography A, 198(2), 193-197

(1980).

8. G. A. Rosenthal, and A. W. Naylor, The Biochemical Journal, 112(4), 415-419 (1969).

9. M. Tewett, and W. Proc., Soo Nat. sci, Biol. Sec., 14 (1903).

Fig. 1.  Structure of Isoflavones

Fig. 2. Analysis Isoflavones of HPLC