통계학적 방법에 의한 Bacillus sp.의 고농도 배양

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

kjklj

이적배지 선정

이백석, 채원복, 조재희, 김영범*, 최성원*,최기현*,김은기

인천 남구 용현동 253 인하대학교 생물공학과,

*경기도 파주시 교하면 상지석리 687-2 그린바이오텍(주)

High Cell Density Cultivation of Bacillus sp. experimental design methods

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

Baek Seok Lee, Won Bok Chae, Jae Hee Cho, Eun Ki Kim.

Young Bum Kim*, Sung Won Choi*, Ki Hyun Choi*.

Department of Biotechnology, Inha University

*.Greenbiotech Co.Ltd.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

서론

가축의 생산성을 향상시키기 위한 방법으로는 항생물질, 성장 홀몬제, 항균제 및 활성제 등을 이용하는 방법이 있다. 화학적으로 합성된 항생물질 의 사용은 축산물 내 잔류문제와 병원균의 내성증가 등의 문제가 나타남에 따라, 최근에는 미생물을 이용한 생균제, 유카제, 효소제, 효모제 등의 활성제를 사료에 배합하여 사용하고 있다. 이런 물질은 환경 친화적인 성격을 나타내고 있어 앞으로 미생물 사료는 여러 분야에서 응용될 것으로 생각된다.

미생물 사료는 사료 첨가제로 사용되며 항생제와 생균제의 역할을 하고 있다. 생균제는 일반적으로 장내 세균총의 변화를 유도하여 대장균을 감소시키며, 병원성 미생물이 소화관 장벽에 부착 정주하여 집락을 형성하는 것을 방지하여[1] 가축에게 급여시 성장촉진과 사료효율의 개선효과가 있다.

또한 항생제의 첨가는 병원성 미생물의 감염을 예방하기 위해 사용하기도 하지만 사료의 소화율을 향상시킴으로서 사료 효율과 증체량을 증가시키는 효과도 있다. 이런 생균제와 항균제를 비교해 보면 생균제의 첨가는 항생제와 같은 목적으로 첨가되지만 항생제는 장내 균을 모두 사멸시키고 생균제는 장내 균총을 유익한 균으로 바꿔 병원성 균의 증식을 억제시킨다.

효소제는 양계사료나 돼지사료에 이용되는 밀, 보리, 귀리 등의 곡류사료는 섬유소 함량이 높아 소화기관내에서의 이용성이 떨어지기 때문에 □-glucanse, pectinase, amylase 등의 효소를 첨가함으로서 비전분성 탄수화물의 이용성을 향상시킬 수 있어 소화율 향상과 가축의 생산성이 개선된다. [2]

여러종의 Bacillus sp.는 미생물 농약이나 이런 사료의 원료로 많이 사용되고 있다. 산업에 이용되는 Bacillus sp.는 장기 보관을 위해 포자로의 전환이 필요한데, 포자 전환시 생균수가 급격히 감소되는 경향이 있다. 따라서 Bacillus sp.가 산업에 이용되기 위해서는 대량 생산을 위한 최적 배지 조성의 확립과 손쉬운 배양 조건이 필수적이다. Bacillus sp.의 고농도 배양을 위해 종전에는 □one factor at a time'의 방법으로 많이 이용하였지만 이 방법은 비효율 적이다. 따라서 factor 상호간의 관계와 높은 효율을 기대할 수 있는 여러 통계학적 방법이 사용되고 있다. [3,4]

따라서 본 연구는 Bacillus sp.의 고농도 배양을 위해 통계학적 처리방법 중 PBD(Plackett-Burman experimental design)[3]와 BBD(Box-Behnken experimental design)[4]를 병행하여 최적 배지 조성을 구하였고 scale up시 문제가 되는 foam control에 대해서도 연구를 병행하였다.

실험 재료 및 방법

1. 사용 균주 및 배양 조건

본 실험에 사용한 균주는 Bacillus sp.중 B. coagulans, B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis 의 5가지 균주를 사용하였고 (Greenbiotech에서 분양) 배양에는 LB 배지를 기본 배지로 사용하였다. 시험관에 working volumn 10 mL로 전배양후 생산배지에 본 배양을 하였다. 배양 조건은 진탕 배양기에서 250 rpm, 30℃(Bacillus coagulans, 37℃)로 10∼12 시간 배양하였다.

2. 생균수 측정 방법

배양후 균체의 생장을 알아보기 위해 생균수 측정 방법을 사용하였다. 배양 배지내에 녹지 않는 성분이 있어 OD값의 측정이 어려워 생균수 측정 방법을 사용하였는데, 이는 LB 평판 배지에 배양액을 점적한 후 30℃, 6∼8 hr 배양시키고 집락수를 계수 하였다.

3. 최적 배지 선정

최적 배지 조성을 구하기 위해 PBD와 BBD를 병행하여 사용하였다. 먼저 PBD에서 Bacillus sp.의 생장에 큰 영향을 주는 factor 3개를 선정하여 각각의 factor를 □one factor at a time" method [5]를 이용하여 최적 농도 범위를 구하였고, 다시 BBD를 실행하여 최적 농도를 알아냈다.

4. Antifoam test

소포제 실험은 대표적으로 사용되는 antifoam 204(Sigma. St. Louis. USA)와 LS-300(Dow Corning)으로 농도를 달리하여 Bacillus sp.의 생장에 어떠한 영향을 주는지 알아보았다.[6] 또한 vegetable oil이 가격이 비싼 soluble starch를 대신할 수 있는 탄소원으로의 사용 및 foam control이 가능하므로 7가지 vegetable oil(soybean oil, safflower seed oil, sunflower seed oil, olive oil, corn oil, rape seed oil)을 탄소원 대신 사용하여 생장시 영향과 foam control을 함께 확인하였다.

5. Fermentation

Bacillus coagulans의 최적 배지를 가지고 2.5 L jar fermenter에서 배양을 하기 위해 먼저  산소의 영향 실험을 해 보았다. 이를 위해 250 mL flask에서 초기 working volume을 달리여 배양하였다. 초기 pH 역시 6 N NaOH, 3 N HCl로 보정한 후 알아보았다.

결과 및 고찰

1. 최적 배지 선정

PBD와 BBD를 병행하여 Bacillus sp. 5가지의 최적 배지를 선정하였다. Fig.1에서처럼  + effect를 나타내는 3개의 성분을 선택하여 Fig. 2 에서 3개의 main factor에 대한 최적 성분의 범위를 알아보았다. 다시 그 최적 성분의 범위를 +, 0, -로 나누어 Table 1의 조건으로 BBD를 실행하여 최적 배지 조성을 구하였다.

2. Antifoam test

Fig. 3으로 antifoam 204와 LS-300이 고농도 첨가 시 균의 생장에 영향이 있음을 알 수 있었다. 또한 탄소원으로 vegetable oil를 사용한 결과 vegetable oil은 생장에도 좋은 영향을 주며 foam control도 가능하다는 사실을 알 수 있었다

3. Fermentation

Bacillus coagulans가 scale-up시 산소의 영향을 알아보기 위한 실험 결과로 초기 volume이 20 mL일때 높은 생장을 보였다. 따라서 이 균주는 산소의 영향을 많이 받음을 알 수 있었다. 초기 pH를 달리하여 균의 생장을 확인한 결과 pH 7에서 가장 좋은 결과를 보였다. Fig. 4에서는 2.5 L jar fermenter에서 pH와 DO control 없이 배양한 결과이며, Fig. 5에서는 pH와 DO를 control한 결과를 나타냈다. pH와 DO를 control 한 결과 2배정도의 균체량 증가를 볼 수 있었다.

요 약

Bacillus sp.는 미생물 농약이나 사료로 많이 이용되고 있다. 따라서 이 균주들의 고농도 생산을 위해 PBD와 BBD를 병행하여 배지 조성 최적화한 결과 균체량의 상당히 증가됨을 볼 수 있었다. 또한 antifoam 대신 사용한 vegetable oil은 탄소원으로의 이용과 foam control이 가능함을 보았다.

Fig.. PBD of Bacillus coagulans

viable cell counting after 12 hr            culture

Fig. 3. Effect of antifoam test viable cell           counting after 12 hr

Fig. 2. The effect of different concentration of three medium components

Fig. 4. Batch cultivation of B. coagulans          without pH and DO controled in          2.5 L jar fermenter

Fig.5. Batch cultivation of B. coagulans          with pH and DO controled in 2.5 L        jar fermenter

Table 1. Three factor Box-Behnken design for the medium optimization study

component run	Soybean meal	(NH4)2SO4	MgSO4
1	+	0	+
2	-	0	+
3	+	0	-
4	-	0	-
5	0	+	+
6	0	-	+
7	0	+	-
8	0	-	-
9	+	+	0
10	+	-	0
11	-	+	0
12	-	-	0
13	0	0	0
14	0	0	0
15	0	0	0

참고 문헌

[1] Fuller, R. and B. E. Brooker. . Lactobailli which attach to the crop epithelium of          the fowl (1974). Amer. J. Clin. Nutr. 27:1305.

[2] Bedford, M. R., Patience, J. F., Classen, H. L. and Inborr, J. The effect of                dietary enzyme supplementation of rye-and barley-based diet on digestion and           subsequent performance in weanling pigs (1992). Can. J. Anim. Sci. 72:97.

[3] Philippe Jacques, Choukri Hbid, Jacqueline Destin, Hary Razafindralambo, Michel          Paquot, Edwin de Pauw and Philippe Thonart. Optimization of biosurfactant              lipoepetide production from Bacillus subtilis S499 by Placket-Burman design             (1999). Appl. Biochem. Biotech. 77. 223-233.

[4] Park K. M., Reardon K. F. Mwdium optimization for recombinant protein production      by Bacillus subtilis (1996). Biotech. Lett. 18, 6, 737-740.

[5] Pham. P. L., P. Taillandier, M. Delmas and P. Strehaiano. Optimization of a               culture medium for xylanase production by Bacillus sp. using statistical experimental       design (1998). World J. Microbio. Biotech. 14, 185-191.

[6] Koch V., Ruffer H. M., Schugerl K., Innertsberger E., Menzel H. & Weis J.              Effect of antifoam agents on the medium and microbial cell properties and process       performance in small and large reactors (1995). Process Biochem. 30, 5, 435-446.