효소의 고정화 방법에 따른 Starch 가수분해반응 경향의 연구

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

장경호, 박대원, 안익성, 함승주

연세대학교 화학공학과

Study on the reaction behavior of starch hydrolysis by various immobilized enzyme

Kyongho Jang, Dae-won Park, Ik-sung Ahn, Seungjoo Haam

Dept. of Chemical Engineering Yonsei University

서론

면섬유 전처리 공정중의 하나인 호부공정은 미완성된 중간 섬유제품에 화학약품을 처리하는 공정으로, 면섬유의 특성을 좌우한다. 이 호부공정에서는 starch류, 개질 starch류 등의 호제를 사용하고 있는데, 이로인해 호부공정 후의 폐수 내에는 starch가 다량 함유되어 있다. 따라서 유기물인 starch가 적절한 처리공정을 거치지 않고 외부로 방출될 경우  환경적인 문제를 유발하게 되므로 호제를 제거하는 공정인 호발공정이 도입된다. 일반적으로 산업 공정에서는 화학약품처리에 의한 산화호발이나 가수분해에 의한 호발등이 사용되나, 이 또한 화학약품의 사용으로 인한 환경문제를 유발하게 된다. 본 연구에서는 이런 문제점을 해결하기 위해 효소 호발에 의한 환경친화적인 공정을 통해 최적 조건을 찾고자 한다. 보통 starch는 glycosidic bond로 알려진 C1 산소를 통해 glucose가 결합된 고분자로 amylopectin과 amylose가 일정한 비율로 혼합된 물질로 amylase류의 효소에 의해 glucose로 분해된다. 본 연구에서는 starch를 분해하기 위하여, 효소를 고정화하여 반응에 이용하였는데, 효소를 고정화하는 이유는 효소의 재사용과 더불어 효소가 가지고 있는 환경에 대한 불안정성을 개선하고, 효소반응의 경제성을 높여주며, 반응 양식을 다양하게 선택할 수 있는 장점을 가지고 있기 때문이다. 고정화 담체로는 Amberlite XAD-16, Silica gel 60을 이용하였으며 담체의 표면성질을 친수성과 소수성으로 조절하여 표면성질에 따른 starch의 분해경향을 검토하여 환경친화적인 공정의 연구를 수행하였다. 또한  효소의 반응성을 비교한 후 최적 반응 효소와 반응 조건을 도출하고 고정화 방법에 따른 고정화효소의 반응성 비교를 그 목적으로 하고 있으며, 산업 공정에서 효소를 이용한 starch 분해시의 기초자료를 제시하고자 한다.

실험

1. 시약

본 실험에 사용된 시약 중 soluble starch는 SHOWA사 (JAPAN)에서 구입하였고,    □-amylase, amyloglucosidase, glucose[Trinder] 100, amberlite XAD-16, silica gel 60,   3-aminopropyltriethoxysilane은 Sigma사(St,Louis,MO)에서 구입하였으며, glutaraldehyde, polyethyleneimine는 Merck사(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다.

2. 유리 효소 최적 반응 조건

starch solution은 10g/l로 제조하여 50ml 반응기에서 15분 동안 60℃에서 반응시켜 생성된 glucose 농도를 근거로 하여 반응 조건을 결정하였다. 최적 효소는 □-amylase, □-amylase와amyloglucosidase의 혼합물, amyloglucosidase의 세 종의 효소를 이용해 반응성을 검토하여 산정하였다. 또한 10~1000units/ml의 농도 범위하에서 최적 효소 반응 농도를 알아 보았다. 또한 pH 3.0~7.0의 범위하에서 pH를 결정하였으며, glucose의 분석은 sigma사의 glucose assay kit(glucose[Trinder]100)를 이용하여 측정하였다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

3. 고정화 효소 최적 반응 조건

담체로는 Amberlite XAD-16과 Silica gel 60을 사용하여 고정화에 이용하였다.

Amberilite XAD-16에의 고정화시 Amberlite XAD-16 2g을 2ml의 polyethyleneimine 과 pH 7.0 인산염 완충액 18ml 에 1시간 동안 교반하여 담체에 아미노기를 도입시킨 후, glutaraldehyde 4ml를 첨가한후 상온에서 2시간 동안 교반하여 알데히드기를 도입시키고, pH 5.5 초산염 완충액에 400units/ml로 조제한 amyloglucosidase 효소 수용액 20ml와 3시간동안 반응시켜 고정화 하였다.  Silica gel 60의 경우는 담체 2g을 90℃에서 1시간동안 5%(v/v)의 질산 수용액과 접촉시켜 전처리를 수행하였다. 전처리된 Silica gel의 수용상 실란화는 10%(v/v)의 3-aminopropyltriethoxysilane 수용액 50ml와 담체 2g을 75℃에서 2시간 동안 실시하였으며, 유기상 실란화는 Silica gel 2g을 2%(v/v)의 3-aminopropyl triethoxysilane-acetone 수용액 150ml와 접촉시켜 45℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 이렇게 각각 실란화된 silica gel의 고정화는 먼저 4ml polyethyleneimine과 pH 8.0 붕산염 완충액 32ml에 2g의 전처리된 Silica를 1시간동안 교반시킨후 144ml의 인산염 완충액과 16ml의 glutaraldehyde, 그리고 160□l triethylamine과 함께 3시간동안 교반시키고 pH 5.5 초산염 완충액에 400units/ml로 조제한 amyloglucosidase 효소 수용액 20ml를 3시간동안 반응시켜 고정화 하였다.

이렇게 고정화된 효소들을 각각 60℃에서 24시간 동안 반응시켜 2시간 간격으로 반응성을 측정하였다.

결과 및 토론

일반적으로 starch를 가수분해하여 glucose로 분해하는 효소는 amyloglucosidase, □-amylase가 있는데, Figure 1에서 보는 바와 같이 amyloglucosidase와 □-amylase를 혼합하여 사용한 것이 가장 높은 효율을 보여 주었다. 이것은 □-amylase가 □-1,4 글루코시드 결합을 무작위적으로 분해하면, amyloglucosidase 다시 □-1,4 결합과 □-1,6 결합을 차례로 분해하기 때문으로 사료된다. 그러나 생성된 glucose를 단독으로 사용하였을때와 비교하여 많은 차이가 없었으며, 경제적으로도 두 효소를 혼용하여 사용하는 것보다는 단독으로 사용하는 것이 유리하기 때문에 최적효소를 amyloglucosidase로 선정하였다. Figure 2는 서로다른 농도의 유리 amyloglucosidase를 이용하여 반응성을 검토한 것으로, 효소의 농도가 증가할수록 생성되는 glucose의 양도 증가하는 경향을 보였으나, 400units/ml 이상에서는 효소농도의 증가량에 따른 glucose의 상대 생성량이 낮았으며 반응계 내에서의 점도가 증가하여 교반이 용이하지 못하여 최적 효소농도를 400units/ml로 결정하였다. pH에 따른 starch의 분해시에는 pH 5.5를 최고점으로 하여 약산성과 중성조건하에서는 반응성이 급격히 떨어지는 것으로 나타났다. Figure 4는 담체의 표면성질을 달리한 고정화효소의 반응성을 나타내고 있다. 담체의 표면을 친수성으로 조절한 silica gel 60 과 amberlite XAD-16이 소수성으로 조절된  silica gel 60 보다 우수한 결과를 보여주고 있는데, 이는 starch solution이 상대적으로 친수성 성질을 나타내고 있으므로 소수성으로 조절된 담체 표면 보다는 친수성으로 조절된 담체 표면으로의 기질 접근이 용이하여 효소-기질 간의 착화합물 생성에 담체표면이 친수성으로 조절된 고정화 효소가 유리하게 작용한 것으로 사료된다.

참고문헌

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Figure 1. Glucose concentration with

different types of free

enzymes

Amyloglucosidase (units)

Figure 2. Glucose concentration with

variations of enzyme

concentrations

pH

Figure 3. Effect of pH  on starch

hydrolysis

Figure 4. Glucose concentration with

different surface

characteristics of enzymes