생물학적 방제를 위한 생물계면활성제 생산

이백석*, 최성원**, 최기현**, 이재호**, 김은기*

인하대학교 생물공학과*, 그린바이오텍(주)**

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Isolation and Production of Biosurfactant (Lipopeptide)

for Biological Control of Plant Pathogen

Theories abd Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

Baek Seok Lee1, Sung Won Choi2, Kee Hyun Choi2, Jae Ho Lee2

and Eun Ki Kim1

1Department of Biological Engineering, Inha University

2Greenbiotech Co. Ltd.

서론

현재 식물전염병 방제를 위해 사용된 맹독성 화학농약의 잔류에 의한 생물농축, 토양 및 수질오염은 심각한 실정이다. 특히 토양전염병의 방제는 기존 화학 살균제 사용이 거의 불가능하거나 방제효과가 극히 낮고 기존 화학농약에 대한 내성 병원균이 발생하여 사용량이 증가하고 있어 인체에 안전한 무공해 농산물을 생산하기 위해서는 미생물농약이 필요한 실정이다.

또한 종자에 미생물을 처리하여 작물의 생장을 촉진시키고 식물병을 방제하는 기술이 선진국에서 개발·경쟁하고 있는 실정이고 환경보전형 농업에 대한 소비자의 인식 제고와 정부의 관련법 제정 등의 지원으로 미생물농약 부분에 대한 관심이 고조되고 있다.

따라서 항균성 물질을 생산하는 균주의 개발은 엄청난 부가가치를 창출할 수 있고 생물학적 방제를 통한 농산물의 품질향상으로 수출에 기여하리라 예상된다.

국내에서 미생물농약 부분 중 가장 큰 시장이 형성되어 있는 골프장 잔디병을 일으키는 Pythium sp. 및 Rhizoctonia sp.를 방제·억제하는 미생물농약에는 Bacillus sp. 계열의 균주가 많이 사용되고 있다.1)

미생물농약(제제)의 주요 구성 미생물은 Bacillus sp.로서 lipopeptide 계열의 항균물질이 생산되고 있으며 포자를 형성하여 토양 유래의 식물병원균에 대해 지속적인 방제·억제 효과를 나타낼 수 있다.2)

따라서 본 연구에서는 무병토양 및 퇴비로부터 분리한 길항후보균 100 여종을 식물병원균에 대한 길항력과 생장속도를 고려한 2차원적인 선정방법인 RPI (Relative Performance Indies) 기법을 이용하여 우수균을 선정하고 lipopeptide 계열의 항균물질을 분리하는 것을 목적으로 하였다.

실험

후보균 (#1 ∼ #87) 중 길항균의 선정은 식물병원균인 Pythium sp., Rhizoctonia sp.에 대한 길항력과 생장속도를 고려하여 길항균 선정시 RPI (Relative Performance Indies) 기법을 도입하였다.2)

ⅰ) 식물병원균의 길항력에 대한 RPIEfficacy

RPIEfficacy = [eqn: [ LEFT { (x-barx )/ sigma RIGHT } -2] TIMES 25]

x ; single observation value, [eqn: bar x] ; average of all observations,

□ ; standard deviation

ⅱ) 후보균의 생장속도에 대한 RPIKinetics

RPIKinetics = [eqn: [ LEFT { (x-barx )/ sigma RIGHT } +2] TIMES 25]

Efficacy는 PDA (Potato Dextrose Agar) plate에서 대칭배양하여 후보균들의 inhibition rate를 측정하였다 (Fig. 1).

inhibition rate = (control - experiment)/control × 100

Pythium sp.의 경우 생장속도가 빨라 대칭배양시 후보균과의 거리를 5cm로 하였고 (2일 배양) Rhizoctonia sp.는 4 cm로 하였다 (3일 배양).

Kinetics는 후보균들을 15 mL test tube에 5 mL LBS 배지 (soluble starch ; 10g/L, tryptone ; 10 g/L, yeast extract ; 5 g/L, NaCl ; 5 g/L)에서 30℃, 16시간 1차 배양 후 30 mL test tube에 10 mL의 LBS에서 2차 배양 (30℃, 12 hr)하여 최종 OD600값을 이용하였다.

계면활성제 생산 유무를 확인하기 위해 #65, #66, Bacillus subtilis ATCC 21332, Bacillus sp. H6를 각각 배양한 후 상등액을 분리하여 표면장력 (Surface Tensiomat21, Fisher)을 측정한 결과 각각 30 mN/m 이상의 표면장력 감소효과를 보였다.

#65 균주를 LBS 배지에서 20시간 배양 후 원심분리 (9000 rpm, 4℃, 15 min)하여 상등액을 분리하였다. 상등액을 conc. HCl을 이용하여 pH 2로 적정한 후 (흰색 침전 형성) 4℃에 24시간 보관하였다. 이를 2차 원심분리 (12000 rpm, 4℃, 15 min)하여 침전물을 회수한 후 혼합유기용매로 추출한 후 rotary vacuum evaporator (Eyela N-1, Tokyo Rikakikai co. Japan)로 감압하여 용매를 증발시켜 yellowish white 결정체를 회수하였다.

회수한 결정체가 lipopeptide 계열물질임을 확인하기 위해 TLC (Silica gel 60 F254, Merck, Germany) plate에 전개시킨 후 (mobile phase ; CH3Cl : CH3OH : H2O = 65 : 25 : 4) 30% H2SO4, 0.2% ninhydrin으로 발색시켜 확인하였다.

시판되는 lipopeptide인 surfactin (Wako Chemical, Japan)과 생산물질을 비교하기 위해 #65 균주의 배양액 0.5 mL에 0.5 mL methanol을 첨가하여 추출한 후 원심분리 (13000 rpm, 15 min)하여 상등액을 0.45 □ filter로 여과하였다. 여과액 20□L를 HPLC (GBC, Austraillia)에 주입하였고 UVdetector (205 nm)로 측정하였다 (mobile phase ; acetonitrile/3.8 mM trifluoroacetic acid = 4/1 (v/v), column ; 4.6 mm□ × 250 mm ODS-2, flow rate ; 1.5 mL/min).

결과 및 토론

대칭배양

Pythium sp. 및 Rhizoctonia sp.에 대한 대칭배양은 Fig. 1에서와 같이 후보균을 streaking하지 않은 대조구와 streaking한 실험구에서의 각각 균사길이를 측정하여 inhibition rate를 계산하였다. 후보균 중 Pythium sp.에 대한 inhibition rate는 일반적으로 작았고 가장 큰 값은 #49, #70의 27.1%였으며 Rhizoctonia sp.에 대한 가장 큰 inhibition rate는 #43의 51.5%였다.

Figure 1. Dual culture of Rhizoctonia sp.

Figure 2. Use of relative performance         Figure 3. Surface tension of antagonistic

indices (RPI) to achieve a 2-dimensional      organisms, respectively

assessment of antagonistic organism

based on growth and efficacy of

liquid-grown cells

세포생장에 대한 RPIKinetics, Pythium sp.에 대한 길항력 효과 (RPIEfficacy-P), Rhizoctonia sp.에 대한 길항력 (RPIEfficacy-P)를 각각 계산한 후 세 값의 평균으로 RPIOverall값을 구하여 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2에서와 같이 후보균 중 #19 균주가 13.1의 가장 큰 RPI값을 보였다.

표면장력

#65, #66, Bacillus subtilis ATCC 21332, Bacillus sp. H6를 각각 배양한 후 상등액을 분리하여 표면장력 (Surface Tensiomat21, Fisher)을 측정한 결과 30 dyne/cm 이상의 표면장력 감소효과를 보였다. 따라서 각 균주는 표면장력을 감소시키는 생물계면활성제를 생산한다고 사료된다 (Fig. 3).

HPLC

Fig. 4에서와 같이 시판되는 Wako chemical (Japan)사의 surfactin과는 다른 retention time에서 peak가 형성되며 Densitometer(CD60 HPTLC, Desaga, Germany)에서 측정되는 최적파장도 상이하여 #65 균주가 생산하는 생물계면활성제는 동일물질이 아니라 판단된다.

Figure 4. Comparison of HPLC peak (Surfactin, #65-BS)

참고문헌

1. Asaka O. and Makoto Shoda, □Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off tomato with Bacillus subtilis RB14□ (1996), Appl and Environ Microbiol., 62(11), 4081-4085.

2. Ohno A., Takashi Ano and Makoto Shoda, □Effect of temperature on production of lipopeptide antibiotics, iturin A and surfactin by a dual producer Bacillus subtilis RB14, in solid-state fermentation□ (1995), J of Fermen and Bioeng., 80(5), 517-519.

3. Schisler D. A. and P. J. Slininger, "Microbial selection strategies that enhance the likelihood of developing commercial biological control products" (1997), J Indust Microbiol Biotechnol., 19, 172-179.