Bio-Rex 젤을 이용한 난백으로 부터의 Lysozyme의 분리

김형원, 박인규, 송재양, 김인호

충남대학교 공과대학 화학공학과

The Purification of Lysozyme from Egg White by Ion Exchange

Column Chromatography

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

Hyoung-Won Kim, In-Kyu Park, Jae-Yang Song and In-Ho Kim

Department of Chemical Engineering

Chungnam National University, Daejon 305-764

Theorise and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

서론

Lysozyme은 1922년 Alexander Fleming에 의해 최초로 발견된 용균효소로서, Micrococcus lysodeikticus같은 세균이나 다른 그람 양성세균과 음성세균을 용균시키는 특성을 갖는 효소로 처음 보고되었다. Lysozyme은 생리액인 눈물, 콧물, 타액, 우유, 혈청등에 존재하며 papaya latex와 순무(turnip)같은 식물조직과 난백, 세균내부, 그리고 airborne bacteria가 침투하기 쉬운 눈, 코, 입, 폐 등 모든 기관에 존재한다[1]. 또한 용균작용 외에도 virus의 불활성화와 단백질의 소화, 흡수촉진에 도움을 준다. 이런 효과들을 이용하여 lysozyme을 식품의 보존료와 의약품원료 및 유아식의 영양강화 부분에 사용하고 있다. 이상과 같이 유용한 천연물질인  lysozyme은 특히 난백 중에 함량이 약 0.3%로 가장 높다. 난백은 다른 lysozyme 함유물질에 비하여 생산량이 풍부하며, 추출조작이 비교적 용이하기 때문에 lysozyme 추출원료로 가장 적합한 것으로 알려져 있다.

난백에서 lysozyme 추출은 직접결정화법, 친화성 크로마토그래피법, 이온교환 크로마토그래피법 및 한외여과법 등이 시도되어 왔는데 수율 및 순도가 높고 추출 후 난백의 재활용이 가능한 이온교환 크로마토그래피법이 산업적으로 이용되고 있다[2].

이에 본 연구에서는 양이온교환수지, Bio-Rex 70 젤을 이용하여  젤의 등온흡착선을 구한 후 난백으로부터 lysozyme을 정제하여 추출시 수율과 순도를 확인해 보려 한다. 용출획분의 단백질의 농도를 정량한 후, 그 결과를 전기영동으로 확인하였다. 또 lysozyme의 활성을 알아보기 위해 역가도 측정하였다.

실험

1. 난백의 준비

일반 수퍼에서 구입한 달걀을 난백과 난황으로 분리한 후 난백을 증류수로 10배 희석하였다. 이 희석용액을 4시간 교반한 후에 원심분리기를 이용하여 8,000 rpm에서 30분간 분리하여 불용성 물질은 제거하고 균질화된 상등액만을 취하여 시료로 사용하였다.

2. 등온흡착선

젤의 흡착용량을 알기 위하여 균질화시킨 난백의 주입양에 따른 등온흡착선을 구하였다. 부피가 3ml인 Bio-rex 70 젤에 난백의 양을 3g, 7g, 10g, 13g, 15g, 20g, 25g으로 변화를 주었고 여기에 0.02M 인산 완충 용액(pH 7.0)을 넣어 총 부피가 28ml이 되게 하였다. 2시간동안 방치하면서 간헐적으로 흔들어 주은 후 다시 0.02M 인산 완충 용액(pH 7.0)을 넣어 젤을 washing한 다음 1M NaCl 20ml을 넣고 30분간 탈착시킨 상등액을 얻었다. 이 용액을 Lowry method로 정량하여 포화점을 찾아보았다.

3. 크로마토그래피

본 실험에 사용한 이온교환 컬럼은 25mm ID × 330mm L 유리컬럼(Spectra/chrom co.)을 사용하였고 양이온교환 수지로는 작용기가 carboxylic acid group인 Bio-Rex 70 Resin(Bio-Rad Labortories)을 사용하였다. 완충용액은 pH 7인 0.02M 인산 완충 용액을 사용하여 계를 평형화시켰다. 용리 용액은 NaCl을 사용하였는데, 0.2M과 0.5M 두 가지 농도의 용액으로 용리하였다. Fig. 1과 같은 순서로 실험을 하였으며 각 단계에의 실험조건은 Table 1과 같다.

Equilibration step    : Buffer 1

Sample loading step : Diluted egg white  by distillate water(×10)

Washing step       : Buffer 1

1st elution step     : Solution 1

2nd elution step    : Solution 2

Equilibration step   : Buffer 1

Fig. 1. Flow chart of ion exchange chromatography for purification of lysozyme from          egg white; buffer 1 : 0.02M phosphate buffer (pH 7.0), solution 1 : 0.2M              NaCl, solution 2 : 0.5M NaCl.

Table 1. Condition of ion exchange chromatography.

Resin bed volume Flow rate and time equilibration sample loading(egg white) washing 1st elution 2nd elution Equilibrium and washing buffer Elution solution	17.7ml 4.5ml/min for 20min 1.5ml/min for 30min 4.5ml/min for 10min 1.5ml/min for 10min 1.5ml/min for 20min 0.02M phosphate buffer (pH 7), 1st : 0.2M NaCl, 2nd : 0.5M NaCl

3. 정량 분석방법

샘플의 단백질 함량은 HPLC를 이용하였다. 컬럼은 Biobasic C-8(Thermo Hypersil Co., 150 × 4.6mm)을 사용하였고 이동상의 조성은 ACN에 0.1%의 TFA를 섞은 것과 0.02M 인산 완충용액(ph 7.0)에 0.1%의 TFA를 첨가한 것을 각각 50% 섞어 사용하였다. Flow rate는 1.0ml/min이었고 254nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

4. 역가 측정

샘플의 역가는 Sigma Chemical 사(Bulletin 11-77 for Lysozyme Prod. No. L-6876)에서

고안한 turbidimetric assay를 수정하여 실행한 Li-Chan 등의 방법으로 측정하였다. 실온

에서, 기질인 Micrococcus luteus 0.015g을 0.066M 인산 완충용액(pH 6.24) 100ml에 녹인 현탁액을 450nm에서 흡광도가 0.6에서 0.7사이게 되게 준비하였다. 현탁액 2.5ml에 대한 lysozyme 용액 0.1ml를 가하여 2분간 10초마다 흡광도 값을 측정하였다. 역가 표시 단위인 unit는 현탁액과 샘플용액을 가한 용액 2.6ml이 450nm에서 흡광도 변화의 값이 1분당 0.001 변하는 것으로 정의하며 역가는 lysozyme의 mg 당 unit으로 표시하였다[5].

결과 및 토론

1. Bio-rex 젤의 등온흡착선

탈착액을 취하여 Lowry method로 단백질을 정량해 본 결과는 Fig. 2과 같다. 젤 3ml 당 난백 20g 일 때 포화가 되어 더 이상의 난백을 흡착할 수 없었다. 따라서 이 비율에 맞춰 시료를 주입하였다.

Fig. 2. Capacity of Bio-rex gel.

2. Lysozyme의 분리 및 정량

Bio-rex 젤을 이용하여 난백에서 lysozyme를 분리해 낸 크로마토그램은  아래의 Fig.3과 같다. 수지에 흡착된 단백질과 흡착되지 않은 단백질이 잘 분리된다는 것을 알 수 있다. 0.2M NaCl로 탈착시에 2분간격으로 5개의 시료를, 0.5M NaCl로 탈착시에 2분간격으로 13개의 시료를 얻어 HPLC로 정량하였다. 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 첫 번째, 즉 낮은 농도의 NaCl에 의해서 소량의 단백질이 용출되었으나 주 단백질은 0.5M NaCl에서 잘 탈착이 됨을 알 수 있었다. Fig .3과 Fig. 4를 비교해보면 크로마토그램의 두 번째 용출획분의 거동과 HPLC에 의한 lysozyme 정량의 거동이 일치함을 보인다. 따라서 이온교환 크로마토그래피에 의해서 용출된 단백질에 lysozyme이 상당양이 포함되었음을 알 수 있었다.

Fig. 4 Concentration of eluted sample.

Fig. 3. Ion exchange chromatography            of egg white.

3. 역가측정

앞에서 말한 Li-Chan 등의 방법으로 분취한 샘플의 역가를 측정했다. 1번부터 11번까지의 시료에는 lysozyme의 농도가 높지 않은 반면, 12번 시료부터는 비교적 높은 농도의 lysozyme이 들어 있어 역가측정의 대상으로 삼았다. 다른 연구들에서는 약 3만 단위의 수치가 나온 반면 본 실험에서는 평균 약 5∼6천으로 낮았다. 그 이유는 크게 두가지고 생각할 수 있었다. 첫째는 분리한 lysozyme의 순도가 높지 않았을 경우이고, 두 번째는 역가를 측정한 샘플의 전처리 과정이다. 즉 분리해낸 시료를 탈염과 건조를 통해 순수한 lysozyme의 결정으로 역가를 측정한 경우와 시료를 전처리 없이 역가를 측정한 경우의 차이에 의해 수치가 많이 차이가 낮을 것으로 사료된다. 본 실험에서는 전처리를 하지 않았다.

Fig. 5. Activity of eluted sample.

감사

본 과제는 산업자원부 청정기술개발사업비와 인하대학교 초정밀분리기술 연구센타의 지원에 수행되었으며 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Kim, W. K. and Jung, B. H.: Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 14(3), 279(1999).

2. Park, S. C., Kim, S. J., Kim, H. W., Ahn, T. H., Park, G. M. and Choi, C. H.: Kor.    J. Food Sci. Technol., 22(6), 711(1990).

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

'Theorise and Application of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No.1'

화학공학의 이론과 응용 제권 제1호 2002년

Theorise and Application of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

Theorise and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

3. Ahn, Y. G.: □Purification method of enzyme protein□, Yang Seo Inc., 182(2000).

4. Li-Chan, E., Nakai, S., Sim, J., Bragg, D. B. and Lo, K. V.: J. Food Sci., 51(4),         1032(1986).