분말상의 silica를 이용한 융합 ferritin의 정제

허윤석, 김성규, 정은미, 김인호

충남대학교 공과대학 화학공학과

The purification of fusion ferritin by using with silica powder

Yun Suk Huh, Sung Kyu Kim,  Eun Mi Jung, In Ho Kim

Department of Chemical Engineering

Chungnam National University, Taejon 305-764

서론

철 원소는 생체에 미량 존재하는 무기 물질이지만 꼭 필요한 원소이다. 그것은 산소의 운반, 산화-환원, 효소 반응. 골수에서의 조혈 작용에 관여하며 DNA 대사나 생태계의 질소 순환에도 관여한다. 따라서 철분결핍 해소를 위하여 건조 황산 제일철등의 무기물 제제와 동물(말 또는 소) 비장 조직으로부터 추출된 동물 페리틴이 사용되어 왔다. 그러나 무기물 제제는 복용시 위염, 소화장애등의 심각한 부작용으로 그 사용이 제한되어서 철분 흡수효율이 증진된 동물추출 페리틴이 사용되었다. 하지만 동물 페리틴은 바이러스 내포 가능성이 높아서 그 사용이 금지되었다. 따라서 최근에는, 유전자 재조합 기술을 이용하여 안전성이 검증된 재조합 인간 페리틴이 연구되고 있다.

1937년 Lauflberger에 의해 처음으로 말의 비장과 간에서 최초로 분리가 이뤄진 페리틴은 24개의 유사한 단백질 소단위로 결합되어 있으며 평균 분자량이 450,000정도이다. 1분자의 페리틴은 헤모글로빈 1200분자를 생합성할수 있는 4,500개의 철 원자를 수용할수 있으며 heavy(H)-chain(21kDa) 및 light(L)-chain(19kDa)으로 구별된다. [1,2]페리틴을 재조합 대장균을 이용하여 철 단백질을 발현시키고 이온교환 젤과 GFC(Gel filtration chromatography)등을 이용하여 정제를 하는 방법이 이미 연구가 되어져 있다.[1,3]

본 연구에서는 heavy-chain과 light-chain이 융합된 페리틴을 분말상의 silica에 흡착 시킴으로 오염물질을 제거하였고, 다시 흡착된 페리틴을 탈착 시킨후 DEAE-cellulose[4]를 이용하여 페리틴을 정제하였다.

재료 및 방법

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

균주 및 발효

본 연구에 사용된 재조합 대장균은 생명공학연구소 생물공정실에서 배양된 것을 이용하였다.

전처리 분리 및 전기영동 분석

배양액을 원심분리(8,000rpm, 30min)하여 균체를 수확하였으며, 얻어진 세포들은 washing buffer A(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0mM EDTA, 0.1N NaCl)에 의해 세척한 후 초음파 파쇄기로 세포파쇄를 수행하였다. 세포파쇄후 원심분리를 통해 얻어진 상등액에 silica분말을 넣어 페리틴을 흡착하여 오염물질을 제거하였고, 분말상의 silica에 흡착된 페리틴을 washing buffer B(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0mM EDTA, 5M urea)와 distilled water로 용해후 전기영동을 이용하여 페리틴을 확인하였다. 그 정제 단계는 Fig. 1과 같다. Fig. 1에서 얻어진 여러 시료들은 15% SDS-PAGE에서 확인하였다.

이온교환 크로마토그래피

전처리 시료를 선택하여 DEAE-cellulose gel이 충진된 이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

Fig.. Scheme of the ferritin purification; WB. A: washing buffer A(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0mM EDTA, 0.1N NaCl), WB.B: washing buffer B(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.0mM EDTA, 5M urea).

결과 및 고찰

세포파쇄후 페리틴은 수용성 상태로 많이 존재하였고, 이 수용성 페리틴이 녹아있는 상등액에 분말상의 silica를 첨가하여 페리틴을 흡착하였다. 상등액 샘플과 silica 분말의 적당한 혼합비율은 Fig. 2의 SDS-PAGE 결과에서 보는바와 같다. 즉 silica분말의 농도를 1/200이상으로 하면 대부분의 페리틴을 흡착할 수 있음을 알 수 있었다. silica분말에 흡착된 페리틴은 5M urea와 증류수처리를 통하여 대부분이 용해되어 나온다는 것을 Fig. 3의 15% SDS-PAGE결과에서 확인하였다.

IEC(Ion exchange chromatography)에 주입할 시료는 Fig. 3의 lane 1, 2를 선택하여 혼합후, 2배 희석하여 사용하였다. 준비된 시료를 DEAE-cellulose gel로 충진된 column에 주입하였을 때 얻어진 크로마토그램은 Fig. 4와 같다. Fig. 4에서 gel에 약하게 결합된 페리틴은 1.0M NaCl에서 먼저 용출이 되고, 좀더 강하게 결합된 페리틴이 0.5M NaOH에서 나중에 용출됨을 알 수 있었다. IEC에서 얻은 용출획분을 Fig. 5의 SDS-PAGE에서 확인한 결과 페리틴이 19kDa의 Light(L)-chain과 21kDa의 Heavy(H)-chain, 그리고 H-chain과 L-chain이 결합된(43kDa) 3가지 형태로 함께 존재함을 알 수 있었다.

Fig. 2. Adsorptive efficiency of silica bead according to the change of concentration of silica powder to disrupted cell suspension; M: standard marker, lane 1: disrupted  cell suspension(sample), lane 2:  precipitate of 1/100 concentration silica powder, lane 3: precipitate of 1/200 concentration silica, lane 4: precipitate of 1/330 concentration silica, lane 5: precipitate of 1/500 concentration silica, lane 7: suspension after adsorption of 1/200 concentration silica, lane 8: suspension after adsorption of 1/330 concentration silica, lane 9: suspension after adsorption of 1/500 concentration silica.

Fig. 3. 15% SDS-PAGE of fusion ferritin obtained from various washing steps; lane M: standard marker, lane 1: samples obtained by washing 50.0mM Tris-HCl(pH8.0, 1.0mM EDTA, 5M urea), lane 2: sample obtained by washing with distilled water after 5M urea, lane 3: precipitate after washing with 5M urea and D.W.

Fig. 4. The DEAE-cellulose ion exchange chromatography(IEC) of sample(ⓐ) in a column(2.5cm I.D × 1.9cm L) under conditions of 1.5ml/min flow rate and buffer(20mM Tris-HCl, pH 7.4, ⓑ, ⓓ), 1.0M NaCl(ⓒ), 0.5M NaOH(ⓔ).

Fig. 5. 15% SDS-PAGE of the DEAE-cellulose ion exchange chromatography fraction; lane M: standard marker, lane 1∼2: eluted fractions with 1.0M NaCl, lane 3∼4: eluted fractions from 0.5M NaOH.

참고문헌

1. A.J. Hudson, S. C. Andrews, C. Hawkins, J. M. Williams, M. Izuhara, F. C. Meldrum, S. Mann, P. M. Harrison and J. R. Guest, "Overproduction, purification and characterization of the Escherichia coli ferritin", Eur. J. Biochem., 218, 85-995(1993).

2. Theil, E.C. Annu. Rev. Biochem., 56, 289-315(1987).

3. S. R. Chang, Y. T. Kim and K. S. Kim, "Purification and Characterization of Recombinant Tadpole H-chain Ferritin in Escherichia coli", J. Biochem. Mol. Biol., 28(3), 238-242(1994).

4. F. Raguzzi, E. Lesuisse and R. R. Crichton, "Iron storage in Saccharomyces cerevisiae", Federation of European Bochemical Societies, 231(1), 253-25(1988).