Stirred cell 안에서 modified microsphere를 이용한 혈청단백질과 Lysozyme의  분리과정에 있어서의 투과 flux 변화 고찰

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

장용수, 최성욱, 함승주, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과

Flux variation in the Stirred sell of Mixed proteins using Modified Microspheres

Yongsu Chang, Sung-Wook Choi, Seungjoo Haam, Woo-Sik Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei University

서론

단백질의 분리 및 정제 기술은 의학, 생화학, 화학공학, 생물공학, 식품공학 등 다양한 분야에서 가장 기본적이면서 필수적인 조작이라 할 수 있으며 한 나라의 생명과학의 수준을 가름할 수 있는 지표가 되기도 한다. 단백질의 분리 및 정제법으로는 크로마토그래피법, 침전법, 회분식 흡착법, 겔 전기영동법 등 다양한 방법이 활발히 연구 진행되고 있다. 그러나 각각의 단백질이 갖는 특이성과 복잡성에 의해 한가지의 원리만으로 분리하기보다는 여러 원리들을 조합하여 분리하는 것이 더욱 효율적일 수 있다. 단백질은 모두 20종 이상의 아미노산 펩티드결합으로 중합되어 기본구조가 모두 비슷하여 분리하기에 어려움이 있지만 단백질의 전하, 크기, 소수성 등의 미세한 차이를 이용하면 분리가 가능하다. 또한 단백질의 생체기능은 특정분자를 인식하여 결합하는 특성이 있다. 따라서 단백질의 항원 항체반응과 같은 선택성이 높은 상호작용을 분리 및 정제기술에 적용하려는 많은 연구가 시도되고 있다. 본 연구에서는 단백질분리를 위하여 친화성 리간드를 도입한 microsphere를 제조하여 사용하였다. 유화중합을 통해 얻어진 microsphere는 입자크기가 극도로 균일하며, 작은 입자크기로 인하여 비다공성이면서도 넓은 표면적을 제공할 수 있는 장점이 있다. 또한 합성고분자이기 때문에 표면특성 조절이 용이하여 2단계의 공중합법을 사용하여 표면에 다양한 기능성기를 도입할 수 있다.

본 연구실에서는 기능성 microsphere에의 단백질 흡착에 관여하는 상호작용력에 관한 연구를 집중적으로 수행하여 세가지 상호작용력 (소수성상호작용력, 정전기적상호작용력, 수소작용력)의 상호관계를 최초로 규명해 내었으며 이 결과를 이용하여 modified microsphere 표면에 단백질이 선택적으로 흡착 및 탈착하는 것을 정확하게 제어할 수 있게 되었다. 또한 본 연구실에서는 크로마토그래피의 컬럼 대신 stirred cell을 사용한 연속식 분리공정을 개발하여 2성분 혼합단백질 용액으로부터 target protein을 성공적으로 분리해 낼 수 있었다.

본 연구에서는 stirred cell을 사용한 연속식 분리공정을 이용하여 혈청단백질 (BSA, BHb)과 Lysozyme 혼합액의 분리를 시도하였으며, 연속식 분리공정에 있어서 pH 변화와 기능성기의 변화, 그리고 단백질 농도변화에 따른 투과플럭스의 변화를 고찰하고자 한다.

이론

단백질과 modified microsphere 사이의 상호작용력에는 소수성 상호작용력, 정전기적 상호작용력, 수소결합력, 전하이동 상호작용력 등이 있다. 본 연구실에서는 다양한 표면전하밀도를 지닌 microsphere를 이용하여 상호작용력들 간의 관계를 규명하였다.  단백질 흡착에 관련된 상호작용력에는 크게 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력을 흡착구동력으로 간주한다. 특히 표면전하밀도에 따라 작용하는 주 구동력의 관계가 변화한다. 즉, 소수성상호작용력에 의한 흡착된 단백질의 양은 표면전하밀도의 증가에 따라 감소하고, 정전기적 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 표면전하밀도의 증가에 따라 증가한다. 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력 간의 전이점이 존재하며 소수성 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 등전점 부근에서 최대이며 pH에 의해 민감하게 반응한다. 이에 반하여 정전기적 상호작용력에 의해 흡착된 단백질의 양은 pH에 영향을 받지 않는다. 분리의 구동력으로 소수성 상호작용력과 정전기적 상호작용력을 고려하였다. 이때 소수성 상호작용력은 흡착의 주 구동력으로 작용하며 정전기적 반발력은 흡착을 방해하는 힘으로 작용한다. 본 연구실에서 행해진 회분식 분리실험의 결과 높은 전하밀도를 지닌 microsphere보다 낮은 전하밀도를 지닌 microsphere가 높은 선택도를 나타내었다.  본 분리실험은 BSA과 Lysozyme 그리고 BHb와 Lysozyme 혼합용액에서부터 Lysozyme을 흡착시키고 BSA와 BHb를 용출시키는 과정이다. 본 실험은 낮은 표면전하밀도와 높은 표면전하밀도를 지닌 microsphere를 이용하여 각각 실험이 진행되며, 낮은 표면전하밀도를 지닌 microsphere의 경우 소수성 상호작용력이 주 구동력으로 작용하며, 따라서 흡착시킬 Lysozyme의 등전점인 pH 11에서 최대흡착이 일어나고 BSA와 BHb는 주어진 pH에서 음전하를 띄게 되어 음이온성 microsphere와 정전기적 반발을 일으켜 그대로 용출하게 된다.

실험

1. 단백질의 선택

본 연구에서 사용된 단백질 Bovine Serum Albumin (BSA, A-7906), Bovine Serum Hemoglobin (BHb, H-2500), Lysozyme (Lysozyme, L-6876)는 Sigma-Aldirich 사에서 구입하였으며 탈이온 증류수에 용해시켜 사용하였다.

2. Microsphere의 제조

microsphere는 주 단량체로 styrene을 사용하였으며 공단량체로 MAA(음이온성)을 사용하여 무유화제 회분식 공중합을 행하였다. microshere의 표면을 comonomer로 포화시키기 위해서는 중합이 90%이상 되었을 때 monomer와 comonomer의 일정량을 도입시키는 shot-growth method를 사용하였다. 중합된 microsphere는 이온교환, 세럼교환의 과정을 통하여 세척한 후, SEM으로 입자 크기 및 분포를 결정하였고, 전도도적정으로 표면기능성기의 양을 결정하였으며, Zeta potential analyzer로□-potential을 측정하였다.

3. stirred cell에서의 연속식 분리실험

완충용액은 각각의 단백질의 등전점인 pH 4.5, pH 7.0, pH 11의 phosphate buffer를 제조하여 사용하였으며, 이온강도를 0.01로 고정하여 사용하였다. phosphate buffer와 라텍스를 0.2□ 정밀여과막(Orange Scientific Co.)을 장착한 stirred cell에 넣어 전체부피는 30ml, 비표면적은 0.19m2/ml로 만들었다. stirred cell을 교반기 위에 놓고, 약 1m 위의 높이에서 같은 buffer을 흘려주어 permeate를 정상상태로 만든 다음 완전히 투과 플럭스가 정상상태로 된 후에 단백질을 step input 하였다. 시간에 따른 투과 flux의 변화를 살펴보기 위해 stirred cell을 1분마다 컴퓨터에 RC 232C로 연결되어 있는 저울로 무게를 측정하여 투과 flux를 결정했다. 한편, 파과곡선을 얻기 위해서는 stirred cell을 통하여 나오는 용액을 autosampler로 받아 채취한 용액을 UV spectrophotometer로 흡광도 측정을하였다. 위와 같은 실험을 표면전하의 도입비율이 다른 microsphere 즉, CM-1 (Nc=0.45)과 CM-3 (Nc=5.9)에서 시행하였으며 BSA, BHb 그리고 Lysozyme 단백질의 농도를 (0.1, 0.25, 0.5g/L)로 변화시켜 실험을 반복하였다. 이성분 단백질의 분리실험에서도 각각의 단백질을 1:1 비율로 혼합하여 여러 농도에서 pH에 변화를 주었고, 또한 기능기의 비율이 다른 두 종류의 microsphere에서도 그 유출량을 분석하였다.

결론

본 논문은 stirred cell 안에서 단백질이 modified microsphere에 흡착되는 과정 중의 투과 플럭스의 변화에 관한 연구결과이다. 모델 단백질로는 널리 사용되는 BSA와 BHb 그리고 Lysozyme를 사용하였으며 단백질 농도(0.1, 0.25, 0.5g/L)와 pH(4.5, 7.0, 11)에 변화를 주었고, 기능성기의 갯수(Nc)가 다른 microsphere를 이용하여 실험을 반복하였으며. 시간에 따른 flux의 변화를 고찰하였다.

단성분 단백질의 투과 플럭스 변화에서는 BSA, BHb, Lysozyme 각각의 단백질을 각각의 등전점에서 플럭스 실험을 행한 결과 BSA는 단백질 투입 직후에 플럭스가 증가하다가 감소하는 경향을 보였으며, Lysozyme의 경우는 단백질 투입 후 80분 후 플럭스가 급격히 증가하였다가 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 각각의 단백질이 소수성 상호작용에 의해 microsphere에 흡착되어 proteins-adsorbed microsphere는 흡착이 계속 진행되면서 유효입자가 커지게 되며, 커진 입자의 크기에 의해 플럭스가 증가한 것이다. 단백질의 포화흡착 후에는 더 이상의 흡착은 일어나지 않으며 단백질이 막 기공에 흡착되어 투과 플럭스는 감소하게 된다. 다성분 단백질 혼합액의 투과 플럭스 변화에서는 BSA와  Lysozyme 혼합액, 그리고 BHb와 Lysozyme 혼합액을 각각의 등전점에서 실험한 결과 BSA의 등전점인 pH 4.5에서의 BSA-Lysozyme 혼합액에서는 소수성 상호작용에 의해 BSA의 흡착이 일어나 플럭스가 증가하였으며, 포화흡착 이후부터는 막오염에 의해 플럭스가 감소하는 경향을 보이며, 80분 후에 양전하를 띄고있는 Lysozyme이 음이온성 microsphere와의 흡착이 일어나 플럭스가 미세한 증가를 보이다가 다시 감소하는 경향을 볼 수 있었다.  Lysozyme의 등전점인 pH 11에서의 BSA와 Lysozyme 혼합액에서는 음이온성 microsphere와 음전하를 띄고 있는 BSA가 정전기적 반발력을 먼저 일으켜 먼저 용출되며, 막 투과 과정 중 막오염이 일어나 플럭스가 감소하는 것으로 보인다. BHb 등전점인 pH 7에서의 BHb와 Lysozyme 혼합액에서는 소수성 상호작용에 의하여 BHb의 흡착이 일어나 플럭스가 증가하였고, 양전하를 띄고 있는 Lysozyme이 음이온성 microsphere와 흡착이 일어난 것으로 보인다. Lysozyme의 등전점인 pH 11에서의 BHb와 Lysozyme 혼합액에서는 음이온성 microsphere와 음전하를 띄고 있는 BHb가 정전기적 반발력에 의해 미세한 플럭스 증가를 보였다가 감소하였으며 Lysozyme의 흡착지점에 이르러서는 플럭스가 급격히 증가했다가 감소하는 것으로 나타났다.  단백질 용액의 농도에 따른 실험에서는 농도가 높아지면 포화흡착이 빨리 일어나게 되므로 플럭스가 증가하는 부분이 짧게 된다는 것을 볼 수 있었다. Nc 차이에 의한 플럭스 변화에서는 microsphere만의 투과 플럭스는 표면전하밀도 의해 영향을 받음을 알 수 있었으며, 표면전하밀도가 높을수록 투과 플럭스는 높게 나타나는 경향을 보였다. 이는 표면전하밀도가 높을수록 입자간의 정전기적 반발력이 크기 때문이다.

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

참고문헌

1. J.-Y. Yoon et al., J. Colloid Interface Sci., 177, 613 (1996)

2. J. H. Lee et al, biomed. chromatogr., 12, 330 (1998)

3. A. Rembaum and Z. A. Tokes (Eds.), "Microsphere: Medical and Biological             Applications", CRC Press, 1988.

4. Suki, A. B et al., J. Membr. Sci., 21, 269 (1984)

5. L.B. Bangs. Pure Appl. Chem. 68, 1873 (1996)

6. J.-Y. Yoon, Ph.D. thesis. Yonsei University, Seoul (1998)

7. J.-Y. Yoon, J.-H. Kim and W-S. Kim. colloids Surf. A 153, 415 (1999)

fig.1 Permeate flux of BSA-Lysozyme solution   fig.2 Permeate flux of BSA-Lysozyme solution

with time at pH 4.5                           with time at pH 11

( BSA : Lysozyme = 1 : 1 mixed solution)       ( BSA : Lysozyme = 1 : 1 mixed solution)

fig.3 Permeate flux of BHb-Lysozyme solution  fig.4 Permeate flux of BHb-Lysozyme solution

with time at pH 7                             with time at pH 11

( BHb : Lysozyme = 1 : 1 mixed solution)       ( BHb : Lysozyme = 1 : 1 mixed solution)