HPFA를 이용한 HSA와 (S)-perillyl alcohol의 결합력에 대한 연구

송명석, 王德先, 노경호*

초정밀분리기술센터, 화학공학과, 인하대학교

*Corresponding Author : rowkho@inha.ac.kr

Binding Study of (S)-perillyl alcohol and Human Serum Albumin

using high-performance frontal analysis

Myong Seok Song, Dexian Wang, Kyung Ho Row*

Center for Advanced Bioseparation Technology and Dept. of chemical Eng.,

Inha University, 253 Yonghyun-Dong, Nam-Gu, Incheon 402-751, Korea

*Corresponding Author : rowkho@inha.ac.kr

서론

혈장 단백질과 인체 내의 약리성분 (drug)의 결합은 평형 관계에 의하여 이루어진다. 인체내에서 혈장 단백질과 결합되지 않은 약리성분 (unbound drug)은 쉽게 상처에 도달하여 치료 효과가 높지만, 혈장 단백질과 결합된 약리성분 (bound drug)은 분자 크기 때문에 혈관벽을 통과가 어렵고 약리성분이 상처로 이동하기가 쉽지 않아 치료 효과가 줄어들게 된다. 약리성분의 전달 현상을 규명하기 위해서는 혈장 단백질과 약리성분의 결합력에 대한 연구가 선행되어야 한다. 결과적으로 약리성분의 결합력을 정량적으로 분석하는 것은 치료 효과 연구에 있어 가장 중요한 기준이 된다.

혈장 단백질과 약리성분의 결합 에너지 연구에 있어 많이 이용되는 방법이 HPLC를 이용하는 것이다. 일반적으로 HPLC를 이용하는 분석 방법에는 생체막을 통한 약리성분의 흡착과 혈장 단백질과 결합된 약리성분이 생체막을 통과하기 어렵다는 한계를 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 새로운 연구 방법인 high-performance frontal analysis (HPFA)를 이용하여 결합력을 측정하였다[1-3]. HPFA은 혈장 단백질에 결합된 약리성분이 HPFA 컬럼 내부에서 혈장 단백질에 결합되지 않은 약리성분과 함께 이동되고 농도가 높은 혈장 단백질과 결합하고 있는 약리성분의 분석에 대해서도 적당하다[2]. HPFA를 이용한 약리성분의 결합 매개변수를 측정하는 연구는 약학, 의약 분야에서 새로운 관심 분야로서 연구가 진행되어지고 있다[3].

Perillyl alcohol (POH)은 d-limonene의 생리활성물질이며, 귤의 껍질에서 주로 발견되는 monoterpene류의 화합물이다. POH는 귤껍질 이외에도 라벤더, 박하, 샐러리의 열매에도 많이 포함되어 있다. POH는 키랄 물질로서 (S)-perillyl alcohol (S-POH)와 (R)-perillyl alcohol (R-POH)의 형태로 존재하고, 이성질체 중 의학적 약학적으로 효능이 있다고 생각되는 물질이 S-POH이다. 이 물질은 구조상 화학적 부작용이 없고, 독성이 낮고, 질병에 대한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 피부암, 폐암, 간암, 췌장암등의 가능성 있는 항암제로서 많은 연구가 진행되고 있다[4-6].

본 연구에서는 on-line HPFA방법을 사용하여 HSA와 항암 효과가 있는 약리성분인 S-POH의 결합 매개변수와 단위 HSA에 대한 S-POH의 결합 위치의 수 (binding site number)를 계산하는 것이 연구의 목적이다.

이론

HPFA는 pH=7.4의 phosphate buffer를 사용하여 평형관계를 단순하게 하고 과량의 시료를 주입한다. Fig 1.은 HPFA의 원리에 대한 도식도이다. (a)에서는 시료를 과량으로 HPFA 컬럼에 직적 주입할 때, 혈장 단백질과 결합된 약리성분이 탈착되고, 결과적으로 (c)에서 보는 것처럼 컬럼의 위 부분 근처에서 평형영역이 생기게 된다. 이 영역에서 평형은 세공의 외부 및 내부로 나눌 수 있다. 세공 내부에서의 크로마토그래피적인 고정상과 이동상간의 평형과 세공 외부에서 혈장 단백질과 약리성분의 결합에 관한 평형이다. 평형관계에 의하여 세공 내부의 고정상에서 약리성분의 농도는 세공 외부의 이동상 속의 혈장 단백질과 결합되는 약리성분의 농도와 같게 되고, 용출 농도 곡선이 평평하게 된다. (d)에서 보는 것처럼 컬럼 내부에 혈장 단백질과 결합되지 않은 약리성분의 영역이 발생하게 된다. 이 평평한(plateau) 영역은 사다리꼴 형태로서 용출되고, 평평한 영역에서 약리성분의 농도는 초기의 시료 용액의 혈장 단백질과 결합되지 않은 약리성분의 농도와 같게 된다. 이 평평한 영역은 2개의 평형을 객관적으로 확인시켜 준다. 평평한 피크의 높이는 혈장 단백질과 결합되지 않은 약리성분의 농도와 일치하게 된다[3].

HPFA의 결합에 대한 평형은 다음 식으로 표시할 수 있다[1,2].

r/Cb = nK - rK                              (1)

식 (1)에서 r은 Cb/Cp이고, Cb, Cp, Cu는 혈장 단백질과 결합된 약리성분의 농도, 혈장 단백질의 농도, 결합되지 않은 약리성분의 농도이다. K와 n은 결합 매개변수와 단위 혈장 단백질에 대한 약리성분의 결합 위치의 수를 나타낸다. 식 (1)에서 기울기 -K와 절편 nK를 구 할 수 있어서 궁극적으로 n, K를 얻을 수 있다.

실험

1. 실험재료 및 기기

혈장 단백질과 약리성분으로 HSA와 S-POH를 각각 Fluka Co.와 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였고, 컬럼은 일본의 Nomura사의 diol-silica column (Develosil 100Diol5, 100×4.6 I.D.)을 미국의 Phenomenex Co.로부터 구입하였다. 이동상은 sodium phosphate buffer를 사용하였다. 이동상의 pH와 I (이온세기)를 조절하기 위하여 sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4·2H2O)와 sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O)를 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였다. 물은 2차 증류수로 감압펌프 (Division of Millipore, Waters)와 filter (FH-0.45□)를 이용하여 사용하여 필터를 한 후 사용하였다.

실험에 사용되어진 장치는 온도를 유지하기 위하여 컬럼 오븐 (CTS30 HPLC column oven, 영린기기), 펌프 (M930 solvent delivery pump, 영린기기), 486 검지기 (M 720 Absorbance detector, 영인과학), Reodyne injention valve (5□ sample loop)로 구성되어 있다. 데이터 저장 시스템은 Autochrowin (Ver. 1.42, 영린기기)를 PC에 설치하여 사용하였다. 기존의 HPFA에서는 HPFA 컬럼과 분석용 컬럼을 밸브를 이용하지만[2], 본 연구의 on-line HPFA에서는 HPFA 컬럼만을 사용하여 기존의 HPLC와 마찬가지로 실험을 수행하였다.

2. 시료의 전처리

이동상과 HSA와 S-POH의 혼합 용액의 용매로 사용되는 sodium phosphate buffer는 Sorensen's phosphate buffer 제조방법에 의하여 sodium phosphate monobasic dihydrate와 sodium phosphate dibasic heptahydrate를 각각 0.2 M으로 물에 녹여 19/81 Vol.%로 혼합하여 pH=7.4로 하였다. 이 경우 I=0.17이었다. S-POH는 3 □M으로 20□의 sodium phosphate buffer에 녹였고, HSA는 700 □M으로 20□의 sodium phosphate buffer녹여 50/50 Vol.%로 혼합하였다. HSA와 S-POH가 350 □M과 1.5 □M의 혼합 시료를 컬럼 오븐으로 37 oC에서 3시간 보관하였다.

3. 결합되지 않은 S-POH 농도의 결정

HSA와 S-POH의 혼합 용액 1000 □를 시료 주입 루프에 넣어 주입한다. 시료 주입은 유량과 시간을 이용한 제한적 주입 (restricted injection)방법을 이용하여 HPFA 컬럼으로 주입한다. 주입 부피는 50, 180, 400, 600 □으로 하였다. 주입 부피가 600 □이상에서는 용출곡선이 평평한 영역을 갖게 되었다. 실험에서 이동상은 sodium phosphate buffer이고 UV wavelength는 205□이고, 실험 온도는 컬럼 오븐을 이용하여 37 oC를 유지하였다.

4. Scatchard 분석

HSA의 농도를 350 □M으로 고정하고, S-POH의 농도를 0.5에서 1.5까지 0.25 □M씩 증가시킨 HSA와 S-POH 혼합 용액을 37 oC로 유지되는 컬럼 오븐에서 3시간 유지시켜 다른 시료를 제조하였다. 주입 부피는 HSA와 결합되지 않은 S-POH의 농도 측정으로 얻은 주입 부피로 한다. HSA와 결합되지 않은 S-POH의 농도를 계산하기 위하여 S-POH의 농도가 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 □M인 시료에 대해서 피크의 높이를 실험적으로 측정하였다.

결과 및 고찰

본 연구는 HSA와 S-POH의 결합력에 대한 지표로서 결합 매개변수를 구하고자 한다. 이러한 목적을 위해서 시료에서 HSA와 결합되지 않은 S-POH의 농도를 구해야 한다. HSA와 S-POH가 350와 1.5 □M인 혼합용액을 주입 부피를 증가시켜 평평한 용출곡선이 되는 농도를 측정하였다. Fig. 2는 주입 부피에 따른 용출곡선의 그림이다. Fig. 2에서 보는 것처럼 주입 부피가 600 □이상에서 용출곡선은 평평하게 되었다. 결과적으로 주입 부피가 600 □ 이상일 때 비로소 HSA와 결합되지 않은 S-POH의 농도가 최대가 됨을 알 수 있었다[2]. 본 연구에서 600 □의 주입 부피로 Scatchard 분석을 수행하였다.

HSA의 농도를 일정하게 고정하고 S-POH의 농도에 변화에 따른 HSA에 결합하지 않은 S-POH의 농도를 측정하였다. Fig. 3은  HSA의 농도를 일정하게 고정하고 S-POH의 농도를 변화시킨 용출곡선이다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 각각의 다른 시료에 대해서 모두 평평한 용출 농도 곡선이 되었다. 평평한 용출곡선의 높이로 HSA와 결합되지 않은 S-POH의 농도를 알 수 있었고, 이를 위해서 S-POH의 농도에 대한 용출곡선의 높이를 구하였다. 결과는 y=-201.51x2+910.6x+29.718 (x는 S-POH의 농도, y는 용출곡선의 높이)이었고 이 실험식의 상관도 (r2)는 0.9993으로 실험의 데이터 값에 잘 맞았다. HSA의 농도를 일정하게 고정하고 S-POH의 농도에 변화시킨 시료의 Cu, Cb, Cp를 모두 알 수 있었다. 식 (1)을 이용하여 Scatchard 분석을 수행하였다. Scatchard 분석에 대한 결과로 결합 매개변수(K)는 5.20x106 [M-1]이고, 단위 HSA에 대한 S-POH의 결합위치의 수는 0.00335이었다.

참고문헌

1. Qiao, M., Guo, X., Li, and F., J. Chromator. A., 952, 131 (2002)

2. Shibukawa, A., Kuruda, Y., and Nakagawa, T., Trends in Anal. Chem., 18(2), 549 (1999)

3. Shibukawa, A., Kuruda, Y., and Nakagawa, T.,  J. Phatmaceut. Biomed. Anal., 18, 1047 (1999)

4. Crowell, P. L., Ren, Z., Elson, C. E., and Gould, M. N., J. Bio. Chem., 266, 17679 (1991)

5. Stratton, S. P., Dorr, R. T., and Alberts D. S., European J. Cancer, 36 1292 (2000)

6. Mills, J. J., Chari, R. S., Boyer, I. J., Gould, M. N., and Jirtle, R. L., Cancer Res, 55, 979 (1995)

7 Pinkerton, T. C., J. Chromator. A., 544, 13 (1991)

Figure 1. Schematic view of High-performance frontal analysis.

Figure 2. Effect of injection volume on elution profile of 1.5 □M and 350 □M mixed solution.

(sodium phosphate buffer, 1 □/min, 205 □ UV wavelength, 50-600 □ inj. vol. at 37 oC)

Figure 3. Chromatogram of HPFA

(HSA 350 □M, sodium phosphate buffer, 1 □/min, 205 □ UV wavelength, 600 □, at 37 oC)