| 초록 |
분리된 간세포의 세포수와 생존도를 향상시키기위해서는 관류시키는 버퍼는 37℃의 온도로 유지시키고 버퍼용액은 실리콘튜브를 통과시키면서 90% O2/10% CO2 의 혼합가스로 평형시켜야 하며, 콜라젠 분해 효소(0.05%)는 pH 7.3-7.5로 조정하여준다. 원심분리 조건은 4℃, 500 rpm에서 2분간 원심분리하여 간세포를 회수한다. 이와 같은 조건과 함께 20ml/min의 유속으로 콜라젠 분해 효소 관류시간에 따른 간세포의 세포수와 생존도는 효소관류 10분후가 총세포수와 생존도가 가장높은데, 총세포수는 2 108에 생존도는 약 80%에 이른다. 콜라젠 분해 효소 관류 시간에 따른 간의 digestion 정도는 100 m의 나이론 메쉬의 여과 후 간세포 모양은 5분, 10분 모두 다소 부정형이고, in situ에서의 세포모양을 나타낸다. 그리고 digestion 정도는 10분간의 콜라젠 분해 효소 관류가 5분보다는 다소 잘 이루어진다. Spinner flask에 세포를 접종한 후 약 2∼3일이 지나면 간세포의 spheroid가 형성되며 직경은 평균 80∼110㎛ 내외가 된다. Spheroid의 density는 100 l의 aliquots를 얻어 100 l내의 spheroid의 수를 측정하여 계산하였다. Spheroid의 직경은 배양 5일 후 크게 감소하는데 암모니아가 첨가된 배지를 사용함으로써 spheroid 표면의 세포가 암모니아를 제거하면서 점차 활성을 잃어 교반되어지는 spinner flask의 shear에 의해 표면에서 떨어져 나감으로써 직경이 감소되는 것으로 사료된다. 그리고, spheroid 수가 배양기간이 늘어가면서 점차 감소하는데 spheroid끼리 서로 합쳐져서 그 수가 감소하는 것으로, 배지교환시 부유하고 있는 spheroid나 사멸된 spheroid가 배지와 함께 쉽게 빨려 나오기 때문이라고 생각된다. Spinner flask의 교반속도에 따른 spheroid 형성은 60, 120rpm에서 모두 이루어지고 있고, spheroid의 직경은 60rpm에서 90-110㎛로 120rpm의 50-80㎛보다는 2배 크지만 spheroid의 수에서는 120rpm에서 60rpm보다는 2배 더 많은 수를 가지고 있다. 1mM 정도의 암모니아를 배지에 첨가하여 배양된 spheroid의 신진대사 활동을 암모니아 제거와 요소합성으로 분석하였는데, 암모니아가 첨가된 배지는 교반속도 60rpm에서 spheroid가 형성된 후 배양 3일째의 spheroid에 사용하였다. 암모니아는 24시간 후에 거의 완전히 분해되었음을 알 수 있었다. 암모니아 첨가 배지로 교환해준 2일째의 배양배지에서 암모니아 농도는 빠르게 감소하나, 3, 4일째에서는 암모니아 농도 제거율이 서서히 적어지고 있고, 우레아 합성율도 배양시간이 늘어나면서 점차 감소한다. 교반속도 60rpm에서 만들어진 spheroid표면을 SEM으로 찍어본 결과 in vivo 에서와 같은 규칙적인 세포배열 구조가 보였으며, 수많은 미세융모도 보인다. 또한 bile duct나 혈관의 구조와 같은 macropore duct가 나타났고 이 동관을 통하여 영양분과 배설물이 출입하면서 활성도를 유지하는 것으로 사료된다.
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