| 초록 |
Ceramide는 모든 sphingolipid의 기본구조를 이루고 있으며, 이 ceramide는 다시 sphingoid base라는 기본 골격에 지방산의 acyl chain이 amide bond를 통해 연결된 형태로서 sphingoid base의 종류와 결합되는 지방산의 길이와 종류에 따라 다양한 형태의 구조를 갖게 된다. Sphingolipid는 모든 생물의 membrane의 막 구조를 형성하는 성분으로서 중요한 역할을 할 뿐 아니라 free form으로 존재하는 sphingosine, phytosphingosine을 비롯한 sphingoid base 유도체들은 epidermis의 최상층인 stratum corneum에 분포하면서 미생물에 대한 항균작용을 하는 것으로 알려졌다. 따라서 본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ceramide를 직접 생산하고, cell 생장조건을 변화시켜 생산량을 높게 하는 것이 연구의 목적이다. 배양한 cell은 chloroform과 methanol을 이용하여 lipid를 추출하였고, 추출한 lipid 용액은 chloroform-methanol-water mixture로 층분리를 수행하여 lipid 용액에 들어있는 불순물을 제거하였다. 불순물을 제거한 lipid 용액에서 순도 높은 sphingolipid만을 분리하기 위해 mild alkaline hydrolysis 방법을 수행하였다. Lipid 추출물을 mild alkaline hydrolysis하면 neutral lipid와 glycerophospholipids는 hydrolysis되고 sphingolipid는 안정하므로 보다 높은 순도의 sphingolipid를 회수할 수 있다. 추출, 회수한 sphingolipid는 ACRODISC CR PTFE 0.45 ㎛로 filttering 한 후 HPLC로 분석하였다. Saccharomyces cerevisiae가 생산하는 ceramide의 생산량을 늘리기 위해 cell 배양시 온도와 pH 조건을 변화시켜 배양 후 추출하여 분석하였고, 배양 후 heat shock을 주어 heat stress에 의한 ceramide 생산량 변화를 알아보았다. 정상 HPLC의 분석에서 첨가제 메탄올의 조성은 분석을 시작할 때에 10 vol.%에서 3분까지 70 vol.%로 변화시키면서 각각의 단계에서 선형적인 변화를 주었다. Ceramide의 온도 변화는 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 로 하였고, pH는 4, 5, 6, 7, 8로 실험을 수행하였다. Heat stress에 의한 ceramide의 변화는 배양한 cell을 배양이 끝난 후에 40℃ 로 incubation 하면서 온도변화를 주었다. 시간별로 추출 회수한 결과 40℃ 에서 30분 반응시킨 cell보다 40℃ 에서 1시간 반응시킨 cell 이 피크의 면적을 비교하는 방법으로 ceramide의 생산능을 보면 5.9배 (면적기준)의 ceramide가 존재함을 알 수 있었다.
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